技术路线：
主要实验结果：
1、HOXBLINClncRNA在NPM1c+白血病中特异性上调
HOX基因，特别是HOXA和HOXB聚类基因的上调不仅是AML发病的特点，也是其主要机制。HoxBlinclncRNA已经被证明是在发育过程中激活前HoxB基因转录所必需的。为了确定HOXBLINC是否与HOXB基因一起在AML中异常表达，检测了正常BMMNC细胞和CD34+阳性细胞，以及NPM1c+AML病人中HOXBLINClncRNA的表达，发现HOXBLINClncRNA在NPM1c+AML病人中显著高表达，在TCGA数据发现一样的结果（图1A-B）。表明HOXBLINClncRNA在NPM1c+白血病中特异性上调。
2、HOXBLINC的缺失扰乱了NPM1c+介导的转录程序和白血病发生
随后鉴定了NPM1c+AML和NPM1cWTAML病人中的差异表达基因，与WT相比，有个下调基因和个上调基因，包括HoxBlinc和NPM1c+的特征基因HoxB2-5，HoxA7,9-11，Meis1，Runx1（图1c）。然后，通过RNA-seq分析比较了对照组和HOXBLINCi细胞的全基因组转录组变化。一致地，NPM1c+细胞表现出HOXBLINClncRNA和常见的NPM1c+AML标记基因的高表达(图1d)。有趣的是，在OCI-AML3细胞中抑制HOXBLINC显著抑制了许多NPM1c+标志性基因的转录，如HOXB2-5、HOXA9-11、RUNX1和MEIS1(图1d)。GSEA和GO分析显示，HOXBLINC的缺失会影响NPM1突变、HOXA9通路、癌症、细胞周期、细胞命运、髓样细胞分化以及Wnt和JAK-STAT信号通路中涉及AML的通路和基因（图1e-f）。此外，与对照组相比，HOXBLINCKD显著抑制OCI-AML3细胞增殖（图1g）。当把Dox诱导的HOXBLINCKDOCI-AML3克隆移植到NOD-scidIL2Rγnull(NSG)小鼠，然后进行Dox诱导或对照处理时，与未接受Dox处理的小鼠相比，Dox处理的受体小鼠的生存期显著延长（图1h）。并且HOXBLINCKD显著增加了小鼠预后，以及肿瘤病理改变（图1i-j）。因此，HOXBLINCKD降低了肿瘤负担，并减弱了体内白血病进展，这可能是NPM1c+AML患者的特异性。
图1HOXBLINC在NPM1c+AML患者中被激活，HOXBLINC的缺失扰乱了NPM1c+介导的转录程序和白血病发生
3、HoxBlinc在造血中的转基因表达导致小鼠的AML样致死疾病
已有研究表明，小鼠造血干细胞(HSCs)中人源化NPM1c+敲入等位基因(NPM1c/+)的激活会导致Hox基因过度表达、增强self-real和骨髓增生扩大，以及迟发性AML的发展。由于NPM1c+激活HOXBLINC，而HOXBLINC对NPM1c+介导的转录程序和白血病发生至关重要，因此确定HOXBLINC的激活是否足以导致异常造血和类似于NPM1c/+小鼠的髓系恶性肿瘤非常重要。HoxBlinc在长期(LT)和短期(ST)造血干细胞中表达高，在祖细胞(MPP,CMP和GMP)中表达降低，除了B+B细胞，在成熟细胞系中进一步降低（图2a）。HoxBlinc在造血中的表达模式提示该lncRNA可能在调控HSPC功能中发挥重要作用。为了研究HoxBlinc活化对体内正常造血和白血病发生的影响，构建了HoxBlinc转基因(Tg)小鼠模型，在Vav1启动子和增强子(HS/45-vav载体)的控制下，将全长小鼠HoxBlinccDNA插入小鼠基因组，以确保转基因在造血系统中的特异性表达(图2b)。获得2只HoxBlincTg小鼠。将该转基因插入到Tg第1系18q染色体上Bin1基因的内含子中(图2c)。BM细胞中HoxBlincRNA的表达水平分别是TgLine#1和#2内源性HoxBlinc表达水平的18倍和3倍(图2d)。
对HoxBlincTg(Line#1)小鼠队列的监测显示，1岁以内，67%的HoxBlincTg小鼠(15只中有10只)因病死或被杀，而WT小鼠(n=12只)没有死亡（图2e）。与野生型相比，垂死的HoxBlincTg小鼠表现出体重减轻、肝脾肿大、淋巴结肿大以及脚垫和股骨苍白（图2f）。形态学上，May-Grünwald-Giemsa染色显示母细胞明显增加(图2g，左)。BM细胞自旋制备也显示髓系细胞占优势，未成熟髓系前体增多(图2g，右侧)。骨髓组织切片的形态学评估显示髓样增生伴未成熟髓样前体增多，以髓过氧化物酶(MPO)阳性表明髓样来源（图2h）。此外，HoxBlincTg的组织学评估显示脾脏、肝脏和淋巴结切片正常器官结构扭曲，并有MPO阳性骨髓细胞浸润（图2h-i）。这些数据表明，与NPM1c/+小鼠相似，HoxBlinc过表达小鼠足以引起类似AML的异常血液学特征。
图2HoxBlinc转基因过表达小鼠导致致死性AML
4、HoxBlinc基因表达增强HSC自我更新，扩大骨髓形成
NPM1c+促进HSC自我更新和髓细胞扩张的能力已被明确。为了进一步了解HoxBlinc在AML发病机制中的作用，研究了HoxBlinc过表达对HSPC功能的影响。HoxBlincTgBM细胞中Lin-scale-1+c-Kit+(LSK)细胞的比例明显高于野生型小鼠，而Lin-scale-1-c-Kit+(LK)细胞群与野生型小鼠相似（图3a）。计算ST-HSCsLT-HSCs总数时，股骨和多能祖细胞(MMP)计算基于比例LSK内细胞群和BM多孔性，LT-和ST-HSCs池，但不是MPP明显扩大，尽管只有ST-HSCsLSK内细胞的比例增加（图3b）。当对LK细胞内的每个髓系祖细胞群进行分析时，HoxBlincTg小鼠中GMP的百分比显著高于WT小鼠，但MEP/CMP细胞群的百分比低于WT小鼠（图3c）。因此，HoxBlinc过表达导致HSPC池失调，导致体内造血系统向髓系倾斜。
接下来，通过体外复制、配对子细胞实验和体内竞争移植研究了HoxBlinc过表达对造血干细胞自我更新和再生能力的影响。在HoxBlincTgLSK细胞中，连续4轮的复制电位均显著高于WT细胞(图3d)。使用WT和HoxBlincTg原始CD34?LSK细胞的配对子细胞检测显示，具有对称自我更新能力的HoxBlincTgCD34?LSK细胞比例更高，而进行对称分化或不对称自我更新的细胞比WT减少（图3e）。竞争移植实验表明，HoxBlincTgBM细胞移植后，受体外周血中供体细胞(CD45.2+)嵌合率稳定上升，移植7个月后达到~80%，而WTBM细胞移植后小鼠外周血中CD45.2+细胞群保持在~50%（图3f）。有趣的是，接受HoxBlincTgBM细胞的小鼠在移植后2.5-7个月死亡率更高(图3g)。总体而言，HoxBlinc基因在小鼠中的表达增强了HSC的自我更新，并扩大了骨髓形成，导致AML样疾病，与NPM1c/+小鼠中看到的表型相似。
图3HoxBlinc转基因表达增强HSC自我更新，扩大骨髓形成
5、HoxBlinc的过表达通过提高HSPC+中增强子/启动子染色质的可及性激活NPM1c+标记基因
为了进一步确定HOXBLINC是否是NPM1c+的下游介质，以维持HSPC中NPM1c+标记基因的激活，对8周龄小鼠的WT和HoxBlincTgLSK细胞进行了RNA-seq，总计鉴定到个差异表达基因（图4a）。其中，上调的有个，下调的有个。值得注意的是，在NPM1c/+vs.WTLSK细胞中，27.3%的上调基因和21%的下调基因基因重叠（图4b）。GSEA分析HoxBlincTgvs.WTLSK细胞差异表达基因揭示了与NPM1c/+与WTLSK细胞相似的转录特征和富集通路，包括NPM1-mutated特征，HOXA9致癌途径，HSC增殖，细胞命运的承诺，骨髓分化，Wnt和JAK-STAT信号通路（图4c-d）。
由于HoxBlinc通过招募SETD1A和MLL1复合物，并在HoxB前位点组织活跃的染色质结构域，促进HoxB前基因的表达，NPM1c+或HoxBlincTg引起的HoxBlinc上调可以通过增强子/启动子染色质可及性来激活其在HSPC中的靶基因。为了验证这一点，使用WT、NPM1c/+和HoxBlincTg小鼠的LSK细胞进行了转座酶可及染色质分析高通量测序(ATAC-seq)。巧合的是，NPM1c/+和HoxBlincTgLSK细胞有相当一部分基因表现出启动子可及性的增加(28.9%)或减少(24.3%)（图4e）。此外，NPM1c+或HoxBlincTg使启动子可及性增加的基因中有相当一部分也上调，这些基因包括NPM1c特征基因HoxB2-5、HoxA9-10、Meis1和Runx1，以及其他靶基因如Stat1和Cdr2（图4f-g）。这些结果表明HoxBlinclncRNA的过表达通过增强HSPC中增强子/启动子染色质的可及性特异性激活NPM1c+标记基因。
图4HoxBlinc过表达通过增强LSK细胞启动子染色质的可及性激活NPM1c+标记基因
6、HoxBlinc直接与靶基因结合，介导染色质相互作用，驱动HSPC中的基因调控网络
CTCF边界促进了受限拓扑相关域(TADs)内增强子/启动子的相互作用。作者之前报道了后HOXA位点的CTCF边界建立和维持活跃的TAD，以驱动后HOXA基因表达。为了研究HoxBlinc过表达是否会影响CTCF定义的HoxB位点前TAD域和增强子/启动子调控网络，使用高通量测序捕捉环状染色体构象(4C-seq)使用HoxB位点CTCF结合位点(cbs)作为HoxBlincTg与WTLin?c-Kit+细胞（图5a）。有趣的是，HoxBlinc过表达增强了这些由CBS5/5和/或+43CBS介导的HoxB前位点内的长程相互作用（图5b）。而+73KbCBS(+73CBS)和HoxB13CBS(CBS13)与前HoxB基因不互作，尽管+73CBS与CBS5/6和CBS8/9存在交互作用，但不受HoxBlinc过表达的影响（图5b）。此外，HoxBlinc过表达也诱导了CBS4/5和/或+43CBS与HoxBlinc靶基因如Stat1、Crd2和后HoxA基因启动子区域的长程相互作用，而非HoxBlinc靶基因HoxD（图5c）。这些数据表明，HoxBlinc与CBS4/5和+43CBS协调，促进并维持与NPM1c+标记基因位点的长期染色质相互作用，从而激活它们。
为了完全理解HoxBlinc过表达调控HSPC造血转录程序的机制，进行了ChIRP-seq在WT和HoxBlincTgLin-c-Kit+细胞中绘制基因组HoxBlinc结合位点。HoxBlinc的过表达显著增加了其与HoxB前基因启动子区域和其他反式靶点的结合，如Stat1、Cdr2、Wnt5a、Runx1和后HoxA基因（图5d）。Lin-c-Kit+细胞基因组中HoxBlinc结合位点的整体分布表明，HoxBlinc主要与非编码区相互作用，包括基因间区、内含子和启动子。值得强调的是，HoxBlinc的过表达显著增加了其与启动子和UTR的占用（图5e）。整合来自WT和HoxBlincTgHSPC的ChIRP-seq、RNA-seq和ATAC-seq数据集显示，大约74%的基因HoxBlinc结合增加表现在基因表达水平增加两倍以上（图5f），44.7%的基因表现出启动子染色质可及性增强（图5g）。这些数据表明，HoxBlinc直接结合造血特异性靶基因，主要是NPM1c+特征基因，并介导染色质的长程相互作用，驱动HSPC的基因调控网络。
图5HoxBlinc直接与靶基因结合，介导染色质相互作用，驱动HSPC中的基因调控网络
7、MLL1的募集对于HoxBlinc过表达介导的靶基因表达和HSPC功能异常至关重要
由于HoxBlinc招募SETD1A和MLL1复合物在小鼠ECS衍生的原始红细胞祖细胞的HoxB位点组织活性染色质域。所以作者先证实了人类HOXBLINC与MLL1和SETD1A的相互作用。然后体内外研究SETD1A和MLL1在HoxBlinc过表达介导的HSPC功能异常和白血病发生中是否重要。然而，在HoxBlincTgLSK细胞中，敲除Mll1而非Setd1a能够缓解HoxBlinc过表达介导的异常复制潜能（图6a）。当使用表达慢病*对照或shMll1的HoxBlincTgLinc-Kit+细胞进行移植时，与表达HoxBlincTgLinc-Kit+细胞的shScramble相比，mll1KD显著延长了接受shMll1表达HoxBlincTgLinc-Kit+细胞的受体的存活时间(图6b)。而mll1KD也能很大程度上恢复HoxBlincTg小鼠中CD+/CD11b+未成熟髓系细胞和GMPs的异常扩增以及贫血(图6c,d)。这些数据表明Mll1KD能够缓解HoxBlinc过表达诱导的AML发展。
由于MLL1在HoxBlinc过表达介导的异常造血过程中至关重要，HSPC中HoxBlinc过表达可能通过增加MLL1募集来激活其靶基因，从而提高H3K4me3占用率，以促进增强子/启动子染色质的可及性。为了证实这一点，使用WT和HoxBlincTgLSK细胞进行了MLL1和H3K4me3ChIP-seq。ChIP-seq和CHIRP-seq联合分析显示HoxBlinc和MLL1的基因组结合位点存在高度重叠（图6e-g）。令人惊讶的是，51.2%的基因HoxBlinc结合增加显示MLL1招募增加，其中大部分(31.7%)也显示H3K4me3占用增加，包括NPM1c+-标记基因，如前HoxB、后HoxA、Meis1和Runx1，以及其他造血基因，如Stat1和Cdr2（图6e-g）。这些数据表明，HoxBlinc过表达通过增加MLL1的募集和随后H3K4me3占用的增强来介导靶基因的表达。
图6MLL1的募集对于HoxBlinc过表达介导的靶基因表达和HSPC功能异常至关重要
总之，本文发现HOXBLINC过表达是驱动白血病发生的关键事件，通过控制MLL1招募、染色质结构域和启动子的顺式和反式表达，建立异常NPM1c+标记基因表达程序。因此，本研究不仅为HSC和NPM1突变的AML的生物学提供了分子视角，而且还为NPM1c+AML的药物靶点识别创造了独特的机会。
参考文献：
ZhuGanqian.,LuoHuacheng.,FengYang.,GuryanovaOlgaA.,XuJianfeng.,ChenShi.,LaiQian.,SharmaArati.,XuBing.,ZhaoZhigang.,FengRu.,NiHongyu.,ClaxtonDavid.,GuoYing.,MesaRubenA.,QiuYi.,YangFeng-Chun.,LiWei.,NimerStephenD.,HuangSuming.,XuMingjiang.().HOXBLINClongnon-codingRNAactivationpromotesleukemogenesisinNPM1-mutantacutemyeloidleukemia.NatCommun,12(1),.doi:10./s--95-2谢谢！英拜生物课题整包甲基化
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