关键点
对含有小鼠来源的单链可变片段的嵌合抗原受体(CAR)构建体的预先存在和/或治疗诱导的免疫与某些患者的治疗失败有关，并可能限制重新给药策略的成功。
目前对免疫原性对CART细胞持久性和功能的可能影响知之甚少。
旨在增强CART细胞性能的新技术和/或同种异体CART细胞的应用可能会进一步放大抗CAR免疫反应的可能性，因此需要制定克服此类风险的策略。
可以使用各种监测、缓解和管理方法来降低抗CAR免疫的风险，尽管能够对抗CAR免疫反应进行充分评估的经过验证的分析仍然是一个未满足的需求。
我们主张将CAR相关免疫原性分析纳入CART细胞疗法的临床前和临床研究。
嵌合抗原受体(CAR)是融合蛋白，可将T细胞特异性重定向到肿瘤细胞上表达的表面分子，独立于常规T细胞受体(TCR)-主要组织相容性复合体(MHC)相互作用。CAR通过基因转移导入T细胞[1,2]。抗原识别域通常由小鼠衍生的单克隆抗体组成，作为连续的肽单链可变片段(scFv)，通过提供灵活性的细胞外间隔域引导。ScFv与其目标表位结合并通过模块化细胞内信号域传递激活信号。目前，CART细胞是从外周血衍生的T细胞离体产生的，这些T细胞通常用复制缺陷型载体转导，这些载体将CAR表达序列整合到T细胞基因组中。这些CART细胞随后在培养中大量扩增。注入患者体内后，这些细胞可以识别并消除表达靶抗原的肿瘤细胞。
自体（患者来源）和异体（供体来源）CAR-T细胞已成功地从临床前发展到临床开发，目前用于治疗癌症患者[3,4,5]。迄今为止最成功的CART细胞产品，其中三种靶向B细胞谱系抗原CD19已获得FDA批准（tisagenlecleucel、axicabtageneciloleucel和brexucabtageneautoleucel）。靶向CD19的CART细胞已成为急性B细胞淋巴细胞白血病(B-ALL)或某些侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者的重要治疗选择，在经过大量预处理的患者中诱导完全缓解具有广泛的疾病。这些CART细胞还与细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经*性综合征和其他免疫介导的不良事件有关[6]。迄今为止，由于存在多种障碍，CART细胞在血液系统恶性肿瘤患者中的成功尚未在实体瘤患者中得到复制，这些障碍已在别处进行了详细审查[7,8]。因此，目前的努力旨在提高CART细胞的效力和/或将它们与旨在克服这些障碍的其他治疗方法相结合。
CART细胞有可能诱导针对CAR构建体的非自身成分或源自基因转移载体的残留蛋白的体液和细胞抗CAR免疫反应，这些蛋白具有固有的免疫原性（图1）。反过来，这种反应可能会限制疗效，从而抑制随后施用的CART细胞的成功[9,10,11]。此外，目前在临床开发中的许多CAR的scFv来自小鼠或其他非人单克隆抗体（补充表1）。
已经在患者亚组中检测到了广泛识别小鼠免疫球蛋白scFv的预先存在的抗体，称为人抗小鼠抗体(HAMA)[12,13]。人类或人源化scFv也可以包含非自身序列，因为可变结合片段是通过多个基因重组事件和体细胞超突变产生的。针对特定抗体序列的抗体（例如包含在人scFv中的抗体）被称为抗独特型抗体[14,15]。此外，由几个人类基因编码的蛋白质在单个肽CAR链中的表达会在人类通常不存在的连接处产生融合序列。
迄今为止，尚无确凿证据表明此类抗CAR免疫反应会导致其他报道的不良事件，例如细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经*性综合征；因此，此类*性不是本综述的重点。
图1抗CAR免疫反应的作用机制。获得性抗嵌合抗原受体(CAR)免疫反应可以是体液或细胞的。在主要组织相容性复合体(MHC)的背景下，细胞免疫可能源于外来（小鼠、病*或非自身人类）序列的加工和交叉呈递到CAR分子。来自凋亡或坏死CART细胞的CAR肽可以由抗原呈递细胞展示，并用于引发次级淋巴器官中的T细胞反应（图a）。CAR特异性CD8+T细胞或细胞*性CD4+T细胞[]可以消除通过MHC介导的识别呈递CAR分子片段的CART细胞。体液免疫可以通过滤泡树突细胞呈递给B细胞的凋亡小体中的CAR蛋白引发。在抗CART细胞的支持下，CAR特异性B细胞可以扩增，然后进行类别转换和浆细胞分化，产生具有不同功能的不同类别的免疫球蛋白。抗CAR抗体可能通过多种机制诱导CART细胞死亡，包括抗体依赖性细胞*性，即结合CAR的抗体与先天免疫细胞的Fc受体(FcR)域之间的相互作用，例如自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞，通过释放穿孔素和/或颗粒酶导致细胞*性，或吞噬作用（图b）和补体依赖性细胞*性，这是由于CAR结合抗体激活补体级联反应，导致形成膜攻击复合物和细胞裂解（图c）。CAR结合后，抗CARIgE也可以与肥大细胞的FcR结合，从而促进脱颗粒和CART细胞死亡（图d）。肥大细胞颗粒中多种血管活性介质的过度释放可能导致全身性过敏反应，这在一名患者中是致命的[17]。KIR，杀伤性免疫球蛋白样受体。已经在癌症患者和HIV患者中记录了对转基因细胞*性T细胞的细胞免疫反应，有时与过继转移的T细胞的免疫排斥有关[9,10,11]。特别是，对CAR转基因或源自基因转移载体的残留蛋白具有特异性的T细胞已被证明会消耗和灭活注入的CART细胞[10]。同样，体液免疫的存在和针对CAR构建体的抗体的发展可能会通过中和抗原结合片段和/或促进早期CART细胞凋亡来干扰CART细胞活性。CART细胞应用后，IgE介导的HAMA触发肥大细胞脱颗粒也存在严重全身性过敏反应的小风险，这些患者使用小鼠衍生的scFv和/或小鼠衍生的单克隆抗体对CART细胞进行预敏化[17,18]（图1）。然而，CAR特异性免疫原性对CART细胞输注后临床结果的影响仍然知之甚少，研究也很少。因此，随着开发新的CAR结构以提高疗效和持久性，了解CART细胞免疫原性的起源和机制仍然至关重要，尤其是在实体瘤患者中。在此，我们回顾了已发表的血液病或实体恶性肿瘤患者对CART细胞免疫反应的临床数据，并讨论了在CART细胞产品开发的不同阶段调查、减轻和管理免疫原性风险的策略。
--抗CAR免疫的临床证据--
针对CD19导向的CAR的抗体似乎不会损害初始临床反应
tisagenlecleucel和axicabtageneciloleucel[19,20,21,22]都观察到了对CD19特异性CART细胞的预先存在的体液免疫。接受tisagenlecleucel治疗的绝大多数B-ALL患者(84.6%;n=88)[22]具有预先存在的抗CAR抗体，在难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中报告的比例同样高(91.4%)[19]。
治疗中出现的免疫原性定义为输注后抗CAR抗体的增加，据报道，在弥漫性大B细胞淋巴瘤和B-ALL患者中分别有5%和36.7%[19,21]。据报道，接受axicabtageneciloleucel的患者中存在预先存在的抗CAR抗体的患者要少得多（3%；n=94）[20]，而在接受brexucabtageneautoleucel的患者中，使用两种药物的组合未证实预先存在抗CAR抗体不同的检测[23]。所有这三种产品都含有相同的小鼠衍生scFv(FMC63)；因此，报告的具有预先存在抗体的患者百分比的差异值得注意，并且可以反映用于检测的不同测定法。显然，预先存在的抗体的存在或在输注这些产品后它们的增加与更差的临床反应无关。在涉及具有靶向CD19或CD20的小鼠scFv的CART细胞的其他研究中也观察到这种缺乏临床后果[24,25]。
对CD19特异性CAR的输注后细胞反应可能导致治疗失败
与预先存在的抗体相比，输注后CAR特异性溶细胞T细胞的存在与某些但并非所有临床试验的治疗失败有关[9,10,26,27,28]。第一份关于细胞免疫可能否定治疗效果的报告涉及两名滤泡性淋巴瘤患者接受多次剂量递增的第一代自体CD19导向CART细胞输注。这些CART细胞是通过低效的制造过程生产的，使用T细胞克隆和整合的质粒载体，需要广泛的离体培养[9]。在第一次输注后24小时（个细胞/平方米），两名患者都可检测到细胞，但它们甚至无法持续1周。尽管以更高的剂量重新输注并使用了IL-2支持，但CART细胞并没有在体内存活。这种失败可能部分反映了制造方法，但可能会因T细胞介导的抗CAR反应而加剧，这种反应在第一次输注之前存在，然后在给药后扩大。这种反应针对CAR本身或共同递送的潮霉素磷酸转移酶-HSV1-胸苷激酶融合(HyTK)自杀基因[9]。
同样，在随后的试验中也检测到了T细胞介导的抗CAR反应，这些试验涉及使用基于小鼠的scFv的第二代CD19导向的CART细胞，并在较小程度上使用全人类CAR构建体[27,29]。值得注意的是，环磷酰胺和氟达拉滨的强化淋巴耗竭已被确定为可能降低抗CAR细胞免疫程度的因素[27,28]。在初始施用CD19靶向CART细胞之前，包含这两种药物的调理方案目前被认为是护理方法的标准[30-32]。
CD19特异性CART细胞再输注的成功可能受到细胞免疫的限制
尽管几种血液系统恶性肿瘤患者在淋巴细胞清除后首次输注CD19定向CART细胞的完全缓解率很高，但疾病复发仍然是一个问题，大约30-50%的患者在12个月内出现疾病复发[33]。根据试验，在7-25%的患者中观察到因CD19表达缺失而导致的抗原逃逸[34]。对于那些CD19阳性疾病复发的人来说，重复输注最初的CD19靶向CART细胞产品似乎很有吸引力。然而，对第二次或后续输注的临床反应通常并不理想，完全缓解通常见于25%的患者[35]。此外，尽管淋巴耗竭加剧，但对CAR具有特异性的细胞*性T细胞群已显示在初始输注后在一部分患者中扩增。此类细胞的检测与重新给药后CART细胞产物的扩增不良有关。迄今为止，对于抗CAR细胞*性T细胞识别CAR构建体中的哪些特定表位知之甚少。现有的少数研究大多发现T细胞对用于几种CD19特异性CARs[27,29]的小鼠scFvFMC63具有特异性，并且在较小程度上对转基因的其他部分（例如信号肽接头或铰链结构域）具有特异性。接受CD19特异性CART细胞的19名患者中有3名）[29]（补充表1）。CD19CART细胞以外血液学适应症的免疫原性
目前正在临床开发中的另一种有前途的CART细胞候选物针对浆细胞恶性肿瘤。具体而言，重新定向以识别B细胞成熟抗原(BCMA)的CART细胞在七个大型临床队列（截至年7月）的晚期多发性骨髓瘤患者中诱导了有效的抗肿瘤反应，尽管完全缓解率远低于在B-ALL或NHL[36-38]患者中，反应不如CD19靶向CART细胞持久。所有试验都在大多数患者中使用了淋巴去除（环磷酰胺或氟达拉滨和环磷酰胺），只有一项研究提供了CAR免疫原性的数据[36-42]。
在Xu等人最近描述的一种方法[40]中，一种双特异性CAR靶向两个不同的BCMA表位，使用两个骆驼衍生的抗原结合结构域结合在单个CAR构建体中，诱导最高的完全缓解率达到76%(13/17)多发性骨髓瘤患者。在最初完全缓解后疾病复发的所有患者中都检测到抗CAR抗体，并且与循环CART细胞数量的减少相关。因此，在接受不消耗内源性B细胞的产品的患者中，体液免疫可能与CART细胞失活和治疗失败有关。事实上，BCMA导向的CART细胞消耗的浆细胞可能不足以减弱早期B细胞反应，这些反应驱动对CAR的体液免疫（图2）。
几种新型CART细胞方法正在开发用于其他适应症，例如T细胞恶性肿瘤(NCT)[43]。迄今为止，引入对泛T细胞谱系抗原具有特异性的CAR构建体已被证明具有挑战性，因为CART细胞自相残杀，这是一种涉及CART细胞之间自我杀伤的现象[44,45]。这个过程既会限制产品的有效制造，又会降低细胞在体内的持久性。
这些限制的一个例外是抗CD5CART细胞的开发[46]，其中CD5特异性CART细胞亚群下调内源性CD5表达，从而避免自相残杀并扩大临床应用。正在进行的I期试验的早期报告表明，这种CD5靶向CART细胞对T细胞急性淋巴细胞白血病或T细胞淋巴瘤患者的疗效，没有T细胞发育不全。内源性T细胞的持续消耗理论上可能会阻碍对肿瘤和病原体的适应性免疫反应，但也可能限制抗CAR免疫的程度，从而提高CART细胞的持久性。
CART细胞疗法在实体瘤中的早期试验揭示了抗CAR免疫
在晚期实体瘤患者中使用CART细胞引起临床反应也被证明具有挑战性，部分原因是肿瘤的T细胞浸润较差和/或CART细胞持久性有限7,8，在某些情况下，这与此有关,抗CAR免疫反应[48,49]（图2）。例如，Kershaw等人[16]进行了一项I期试验，以评估使用靶向α-叶酸受体(FRα)的自体第一代CART细胞在转移性卵巢癌患者中进行过继免疫治疗的安全性。这些研究人员观察到抗体介导的对CART细胞的免疫反应抑制了IFNγ释放和对FRα阳性肿瘤细胞的细胞*活性。正如试验中所观察到的，这种反应大大降低了CART细胞的功效，并可能导致它们的快速清除。Hege等人[48]报告了前两项临床试验（在年代进行）的结果，这些试验评估了实体瘤患者的CART细胞，重点是持久性和免疫原性。这些第一代CART细胞产品含有针对肿瘤相关糖蛋白(TAG-72)的人源化抗体(huCC49)，并通过形成huCC49的结合域针对小鼠来源的TAG-的抗CAR抗体引发抗独特型免疫反应[72]。尽管大多数患者反复高剂量输注CART细胞（1×），但这种免疫反应导致在14周内消除了输注的TAG-72CART细胞。一项使用完全小鼠衍生的CC49变体的先前研究表明，抗体本身可能具有具有特别高免疫原性潜力的抗原结合表位，导致大多数患者(54%)产生HAMA反应[13]。后续研究导致下一代huCC49人源化构建体仅带有移植到人抗体上的小鼠TAG-72结合表位的特异性决定残基。这些早期试验证明了在设计用于实体瘤的CART细胞产品时尽量减少小鼠成分的重要性。分析下一代CAR在实体瘤中的免疫原性
涉及第一代CAR构建体的早期研究有助于阐明实体瘤患者免疫原性反应的可能性[16,48,49]。然而，在临床前模型和血液系统恶性肿瘤患者中观察到抗肿瘤反应改善后，这些CART细胞的有限功效促使转向使用第二代CAR。例如，Ahmed等人[56,57]使用自体T细胞表达基于小鼠HER2特异性单克隆抗体FRP5的第二代CAR。在一项试验中，FRP5-scFvHER2外域特异性CART细胞被用于19名晚期HER2阳性肉瘤患者。这些研究人员在重复输注后长达2年的时间里观察到外周血中HER2特异性CAR转基因水平较低但可检测到。在同一组进行的另一项涉及进行性胶质母细胞瘤患者的临床研究中观察到类似的CART细胞动力学。尽管这些以及其他试验显示出不令人满意的临床反应[56-59]，但细胞和体液抗CAR反应的作用并未作为可能导致治疗失败的一个因素进行深入研究。上述研究涉及实体瘤患者，不包括CART细胞输注前的淋巴去除。相比之下，在年7月发表的一份病例报告中，三个循环的淋巴去除，然后输注靶向HER2的第二代CART细胞，使输注细胞的外周扩增和生物利用度得以提高[60]。这种方法在患有转移性横纹肌肉瘤的儿童中产生了完全反应，然后通过重复CART细胞输注进行巩固，没有进一步的淋巴耗竭，但使用抗PD-1抗体。该儿童的纵向免疫监测显示T细胞库重构，具有免疫优势克隆和对致癌途径蛋白具有反应性的血清自身抗体。尽管存在明显的强烈内源性免疫反应，即使在接受总共15次含有小鼠scFv的CART细胞产品输注后，患者仍保持HAMA阴性。根据单个患者的观察得出明确的结论是很困难的。因此，需要进一步研究以更好地阐明抗CAR免疫反应及其与淋巴耗竭的潜在相互作用，特别是在需要重新给药的情况下。最终，使用强化淋巴去除来减轻免疫原性可能有助于改善实体瘤患者的CART细胞植入[61,62,63]。--降低固有的CAR免疫原性--CAR构建体的几个组成部分有可能在患者体内触发抗CAR免疫反应。可以使用各种方法使这些成分的免疫原性降低。人源化肿瘤反应性scFv
一些研究人员正在开发和测试人源化scFv，以规避与小鼠来源的scFv相关的抗CAR反应。人源化构建体的免疫原性可能较低，也可能更适用于初始小鼠衍生CART细胞输注后疾病复发患者的抢救治疗（图3）或作为未使用CART细胞的患者的一种选择[29,50,64,65,66]与接受含有小鼠来源的scFv29的CART细胞的类似队列相比，使用完全人类CD19导向的CAR对B细胞NHL患者进行的首次治疗诱导的CAR特异性T细胞反应更少。另一种策略是用缺乏轻链和潜在免疫原性接头序列（例如重轻链或其他相关连接点）的免疫球蛋白仅重链识别域代替传统的scFv[67]。这些重链CAR构建体在临床前模型中显示出强大的目标亲和力和功效[68,69,70]。
年11月报告了BCMA特异性全人重链构建体的首次临床疗效证明[71]。从理论上讲，仅源自人类蛋白质成分的构建体仍然可以在患者中启动涉及抗独特型抗体的免疫反应[48,72]。因此，直接比较小鼠来源和人源化scFv的免疫原性的头对头临床试验是有必要的。
用替代的肿瘤特异性域交换scFv
除了基于scFv的CARs，肿瘤细胞也可以通过内源性肿瘤特异性受体-配体相互作用靶向。CAR的scFv部分可以被受体的胞外域或与肿瘤过度表达的受体结合的配体替代。目前处于临床前和早期临床评估的部分包括嵌合NKG2D受体[73-75]靶向表达IL-13Rα2的肿瘤细胞的膜系留IL-13细胞因子CARs76、77、78、整合素αvβ6结合肽79、80和调节蛋白-ζ奇美拉斯81。预计这种肿瘤特异性受体-配体相互作用的免疫原性低于传统scFv，因为它们具有人类肽序列，因此很可能被识别为自身蛋白。此外，具有可在体内装载肿瘤靶向抗体的细胞外结构域的通用CAR设计可能能够在抗原逃逸的情况下重新重定向CART细胞特异性82,83。然而，到目前为止，还没有关于使用这种通用受体策略的免疫原性数据。变异CAR间隔
scFv与靶标表位的最佳结合对于有效的CART细胞治疗至关重要。特别是，靠近肿瘤细胞膜的近端表位可能需要具有更长和更灵活铰链域的CART细胞。许多小组使用各种IgG重链的恒定区作为铰链[84,85]。在它们的原始形式中，这些IgG衍生的间隔区中的CH2和CH3结构域可以被Fc受体靶向先天免疫细胞，如巨噬细胞、粒细胞和自然杀伤(NK)细胞，并可能造成免疫原性风险（图1）。事实上，Jensen等人报告的包含CH2结构域的Fc结合间隔区的存在可能导致CD19靶向CART细胞的持久性较差。以及其他临床研究[9,25,86]。这种现象可以通过突变间隔内的Fc受体结合表位来避免，从而防止先天免疫细胞激活[87,88]。--新型CAR技术的免疫原性--
细胞因子自养
旨在增强CART细胞抗肿瘤功效的细胞因子支持技术，特别是为了克服具有免疫抑制微环境的肿瘤中的细胞因子饥饿，是一个广泛的临床前和临床研究领域[7,89]。细胞因子（例如IL-15）的全身给药会增加患者发生免疫原性反应的风险，并可能导致*性反应，例如发烧、寒战、低血压、血小板减少症和淋巴细胞减少症等[90]。因此，使用工程化CART细胞局部释放可溶性细胞因子的其他方法已被使用，在临床前模型中证明了有效的活性[91,92,93]。旁观者T细胞激活是这种旁分泌细胞因子支持策略所固有的理论风险[94,95]。这种方法的早期临床结果令人鼓舞[96]，尽管旁分泌细胞因子支持是否可能放大任何抗CAR反应仍有待阐明。或者，CAR分子内的组成型活性细胞因子受体或细胞因子受体信号结构域可以仅向CART细胞提供免疫调节细胞因子信号，而不会影响旁观者淋巴细胞[97,98]，目前正在临床试验中研究这种策略（NCT和NCT）。自杀基因和消除标记
尽管CART细胞对某些血液系统恶性肿瘤患者有效，但由于靶向、非肿瘤*性和/或附加技术的不可预测的不利影响，它们也会带来安全风险。自杀基因和消除标记已被研究作为可以与CAR转基因一起引入的策略，以便在出现严重不良事件时有针对性地清除基因修饰的细胞产物[11,99,]。然而，这些方法并非没有免疫并发症的风险。例如，Berger等人[99]在表达单纯疱疹病*胸苷激酶(HSV-TK)作为诱导自杀基因的T细胞中发现了多个免疫原性表位，导致由CD4+T细胞和CD8+T介导的快速发展的抗CART细胞反应细胞。因此，如前所述，HSV-TK自杀基因也可能导致在Jensen等人[9]进行的试验中观察到的CD19导向的CART细胞排斥。改编自人类来源蛋白质的安全系统（例如表面结合消除标记，包括截短的EGFR或iCaspase9自杀系统）避免引入可能增加免疫原性风险的异种成分[,,]。为了在CART细胞产品中实施安全基因，许多研究人员选择在单个多顺反子构建体上共表达CAR构建体和自杀开关，这些构建体由内部核糖体进入位点或包含自切割肽的病*2A序列分隔。病*衍生的2A序列在离体研究中未显示具有免疫原性[]，尽管只有前瞻性临床试验才能明确解决其对患者的免疫原性问题。值得注意的是，年发表的研究表明，内部核糖体进入位点插入可能会降低下游转基因（如自杀开关）的表达水平。最近，基因编辑已被用于创建无转基因的自杀开关，以避免转基因相关免疫原性的风险，尽管这种方法目前需要进一步研究[]。使用瞬时传递的核酸酶进行基因编辑
可编程核酸酶提供了一种通过基因编辑增强CART细胞功能的方法。这种方法已被用于破坏内源性免疫检查点蛋白的表达，从而提高CART细胞的性能;-]，并有可能使它们与治疗性单克隆抗体共同给药[]。此外，由于细胞表面抗原表达减少，基因编辑可能会限制自相残杀的程度，从而能够对CART细胞进行临床研究，以检测CD5以外的常见T细胞抗原（如CD3和CD7）[44,45]。重要的是，基因编辑还可用于通过消除细胞表面MHC表达来逃避T细胞介导的抗CAR免疫，正如在体外和体内使用同种异体CART细胞所证明的[,,]（图4）。图4避免同种异体CART细胞免疫消除的策略。a不相容的主要组织相容性复合物(MHC)的存在可以增强对同种异体CART细胞的抗嵌合抗原受体(CAR)反应。静息T细胞表达MHCI类（MHCI），而T细胞在激活后也可以上调MHCII类（MHCII）。b
MHC通过自然杀伤(NK)细胞上的杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)充当有效的抑制性受体。从静止的CART细胞表面消除MHCI可以防止同种免疫反应，同时也会增加NK细胞介导的细胞*性的风险。c
多重基因编辑可用于消除CART细胞表面MHC的表达，同时保留多样性较低的人类白细胞抗原(HLA)-C亚型，这可能会最大限度地降低NK细胞排斥的风险。还应该对供体衍生产品进行仔细的MHC匹配。d
破坏编码MHCII或共同恒定链CD74的主转录调节因子的CIITA的功能表达可用于从细胞表面去除MHCII，而不会引起对激活的CART细胞的同种免疫反应。电子
针对同种异体特异性T细胞上的激活标记4-1BB的同种免疫防御受体(ADR)可能会改善同种异体CART细胞的持久性。引入B2M阴性和MHCI缺陷型CART细胞的ADR可能会主动消除NK细胞裂解的风险。f
将通用MHCI构建体（例如基于负载诱饵肽的单态HLA-E构建体）定点插入B2M基因可防止NK细胞靶向同种异体诱导的多能干细胞。克
或者，CD47的过度表达通过充当“不要吃我”信号来阻止有效的同种异体反应性T细胞/NK细胞激活和抗体依赖性细胞*性(ADCC)。除了意外的脱靶基因编辑事件外，宿主免疫反应的诱导与预先存在的体液和细胞免疫相结合已被确定为与CRISPR-Cas9基因组编辑系统相关的风险因素[-]可能导致T细胞-介导消除表达Cas9的细胞[,]。尽管如此，Stadtmauer等人[]证明，CRISPR-Cas9组分作为核糖核蛋白复合物的临时递送不会影响三名患者的自体TCR重定向T细胞的持久性。免疫原性蛋白的快速降解以及离体扩增过程中的稀释可能解释了这些结果。因此，与组成型过表达相反，瞬时传递可能是在具有完整抗原加工的细胞中进行CART细胞基因编辑的首选方法，并值得进一步研究。
免疫和同种异体CART细胞
使用来自健康供体的细胞创建的现成的同种异体CART细胞产品是自体方法的一种有吸引力的替代方法，并且有可能扩大这些细胞的临床适用性并确保及时可用[]。然而，在这些CART细胞上表达的非自身MHC可以引发宿主衍生的免疫反应，从而导致免疫介导的产物消除。同种异体CART细胞可以被患者的同种异体反应性T细胞靶向，对外来主要MHC抗原具有特异性[,]。即使与部分人类白细胞抗原(HLA)匹配的供体，由于多态性引起的微小抗原差异也可能产生额外的免疫原性表位[]。
事实上，年12月发表的数据（参考文献[]）表明，同种异体CD19特异性TCR的短期抗肿瘤活性需要化学疗法和抗CD52抗体阿仑单抗进行预处理，阿仑单抗同时消耗B细胞和T细胞。在患有难治性B-ALL的成人和儿童患者中编辑T细胞。重要的是，阿仑单抗在输注后还会减少表达CD52的CART细胞；因此，本试验中使用的CART细胞中的CD52被删除。尽管在淋巴耗竭中加入了阿仑单抗，但同种异体CART细胞在内源性T细胞重建后显示出有限的持久性[]。这些结果强调了需要采取策略来克服即使是轻微的HLA错配造成的同种异体反应性免疫障碍。
已使用多种方法来生成MHC抗原表达降低的CART细胞，从而无论HLA差异如何都能对患者进行治疗（图4）。通过直接编辑HLA基因座或破坏MHCI表达所需的编码β2-微球蛋白(B2M)的基因来消除MHCI类(MHCI)，有可能防止CD8+T引起的同种异体排斥细胞[,]。然而，由于T细胞激活导致MHCII上调，异体特异性CD4+T细胞介导的CART细胞排斥也可能发生。通过删除CIITA（MHCII基因的主要转录因子）来消除MHCII表达，可以减轻这种排斥反应[]。这些方法为对抗T细胞介导的排斥提供了一些希望；然而，矛盾的是，HLA分子的丢失使同种异体CART细胞容易受到NK细胞杀伤。因此，已经开发了NK细胞抑制性转基因来促进转基因细胞在免疫活性宿主中的持久性（图4）。例如，Gornalusse等人[]通过在人类多能干细胞中表达与B2M和诱饵抗原融合的非多态性HLA-E分子，开发出对CD8+T细胞和NK细胞的排斥具有抵抗力的细胞。例如，涉及多重基因编辑的其他策略可用于消除高度多态性的HLA-A和HLA-B等位基因，同时保留多样性较低的HLA-C，从而保留重要的内源性NK细胞抑制受体[]。或者，CD47的过度表达可以抑制同种异体反应性T细胞和NK细胞活化，并向吞噬细胞提供“不要吃我”信号，从而防止抗体依赖性细胞*性[,]。
年7月，Mo等人[]发表了一份报告，描述了一种“同种免疫防御受体”，该受体能够通过识别临床前模型中的激活标记4-1BB来实现CART细胞介导的同种异体反应性T细胞和NK细胞的杀伤，而无需HLA系统的遗传修饰。有趣的是，工程免疫细胞表达的同种免疫防御受体既不损害同种异体CART细胞扩增，也不损害小鼠模型中的抗肿瘤免疫反应[]。
广泛的淋巴细胞清除也可以降低立即同种异体排斥的风险,。这种方法的缺点是存在由持续的同种异体CART细胞或保留同种反应性TCR表达的内源性非CAR供体T细胞增殖引起的移植物抗宿主病(GvHD)的可能性。为了降低GvHD的风险，研究人员已将CAR转基因转移到病*特异性T细胞中，从而产生更安全的产品，因为此类细胞的TCR不太可能具有同种异体反应性[57,,,,]。
或者，可以将CAR引入具有受限TCR库的非常规T细胞（例如γδT细胞、粘膜相关不变T细胞、NKT细胞和不变NKT细胞），因为这些都具有较小的GvHD风险[,,]。作为另一种选择，可以使用基因编辑来破坏同种异体CART细胞的TCR。
--临床中的抗CAR免疫反应--
抗CAR免疫反应的纵向研究对于了解免疫原性如何导致治疗失败尤为重要。目前关于使用CD19导向CART细胞的专业协会指南不包括有关疑似抗CAR免疫的评估或临床管理的建议[32,,,]。在本节中，我们概述了开发经过验证的检测方法的必要性，以充分监测CART细胞候选物的免疫原性，并使研究人员能够评估这些反应的临床相关性，并在适当的情况下实施合适的循证缓解和管理策略（图1）。图5临床中抗CAR免疫的监测、缓解和管理。在CART细胞输注之前，通过淋巴清除方案减轻抗CAR免疫可以减少循环淋巴细胞和抗原呈递细胞的数量。此外，细胞减灭治疗可能会减少肿瘤微环境中某些免疫抑制细胞的数量，导致肿瘤细胞死亡并产生促炎环境，从而促进CART细胞的抗肿瘤功效[]。一旦患者考虑接受治疗，就应开始对接受CART细胞的患者进行监测。传统的癌症治疗方案，包括小鼠来源的单克隆抗体，可以在患者体内诱导人抗小鼠抗体(HAMA)[12,13]。因此，仔细评估预先存在的免疫力对于避免CART细胞输注后的过敏反应很重要。随后，临床试验中的监测应包括监测可能的HAMA和特定的抗CAR免疫反应，包括抗体和T细胞分析。在使用相同的CART细胞产品重新给药之前，可以使用重复淋巴细胞去除来降低抗CAR免疫力，从而实现对低水平抗CAR免疫的管理。对于先前输注含有小鼠单链可变片段(scFvs)的CART细胞后出现进展或复发的患者，或需要后续输注以防止疾病进展的患者，可以考虑使用人源化CART细胞构建体。然而，这种方法可能会带来额外的成本和/或治疗延误。
在临床试验和临床实践中监测抗CAR免疫
在输注间皮素特异性CART细胞后观察到由HAMA引起的致死性过敏反应17可能促使监管机构建议在怀疑免疫反应的情况下在I期安全试验中解决免疫原性风险（图5）。在各种临床试验中设计了多种检测方法来测试对CART细胞的体液或细胞免疫反应（框1）。然而，除了HAMA之外，这些检测很少根据临床实验室改进修正案进行认证，目前还没有广泛使用。同时，根据定义，HAMA仅对检测小鼠来源的scFv的抗体有价值。特别是随后输注小鼠衍生的CART细胞之前可以进行HAMA评估，这可能有助于阐明原发性耐药和/或对第二次或后续输注的有限反应的可能机制[]。随着新构建体的人性化，HAMA评估可能变得不那么相关，并且开发新的检测方法，无论是针对人源化构建体还是潜在地用于非小鼠、非人类来源的构建体，都将成为日益增长的需求。在这种伴随检测可用之前，研究人员可以考虑冷冻保存在多个时间点收集的血清样本和外周血单个核细胞，以供以后分析。尽管有报道表明对非人类CAR序列和突变致癌蛋白的有效免疫反应，但很少有涉及实体瘤患者的临床研究调查了HAMA以外的抗CAR抗体反应49,60。鉴于CART细胞扩增和持久性在实体瘤试验中仍不理想，对所用CAR构建体的免疫反应的作用变得越来越重要，应该重新审视。因此，建立用于表征对CAR构建体和相关转基因的体液和细胞免疫反应的验证检测至关重要。旨在检测抗CAR抗体的检测可以基于细胞或酶联免疫吸附检测(ELISA)，理想情况下应该能够测量T细胞表面表达的所有CAR成分的免疫原性，并预测它们对细胞产物（如细胞*性潜力）[]（框1）。对于细胞免疫反应，能够绘制CAR构建体中最具免疫原性表位的分析最有可能为更好的CAR设计和提高疗效的新技术的开发提供信息。总体而言，这些努力还可以受益于通用术语的实施以及从生物制剂（如治疗性蛋白质）免疫原性评估和报告中吸取的经验教训[,,,]。框1旨在监测抗CAR免疫的检测
--细胞免疫--
细胞*性试验
细胞*性测定通过用照射过的表达CAR的靶点刺激，测量体外扩增的T细胞和/或外周血样本中的单核细胞对嵌合抗原受体(CAR)转导的靶细胞（包括T细胞和自体淋巴细胞系）的杀伤。此类检测通常使用51Cr标记对共培养4-6小时后的靶细胞死亡进行量化10、24、27、99。
脱粒试验
脱粒分析测量CDa（也称为Lamp1）表面表达，这表明最近在体外扩增的患者来源的T细胞上分泌了溶细胞囊泡，这些T细胞来自外周血样本，使用流式细胞术与经辐照的CAR表达T细胞共培养10,。
体外增殖试验
体外增殖测定通常通过3H-胸苷掺入或流式细胞术评估（稀释增殖染料，如羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺），在用照射过的表达CAR的靶细胞或CAR-肽混合物刺激后测量患者来源的T细胞的离体增殖。酯或类似物）26。
酶联免疫吸附斑点(ELISpot)检测
ELISpot分析检测体外扩增的患者来源的CAR特异性T细胞释放的IFNγ。这些细胞通常来自外周血单核细胞，然后在受照射的表达CAR的T细胞和IL-2存在下进行2周扩增。共培养后，将这些细胞暴露于辐照后的表达CAR的靶细胞或CAR衍生的肽库。这种方法的优点是能够识别抗CART细胞识别的不同蛋白质片段28,29,。
细胞内细胞因子染色和流式细胞术
细胞内细胞因子染色和流式细胞术涉及在用小鼠衍生的CAR序列跨越肽（或潜在的非小鼠CAR肽）刺激后外周血单核细胞中检测IFNγ或其他产生细胞因子的T细胞。这种方法使用荧光染料标记的抗体进行细胞内染色，通常包括但不限于IFNγ、TNF和/或IL-2和/或激活标记物（如CD和CD40配体）的细胞外染色，然后使用流式细胞术进行定量19,21。
T细胞受体(TCR)谱分析
TCR谱分析涉及下一代测序或使用流式细胞术的TCRVβ光谱分型。这种方法能够根据个体TCR互补性定义区域或TCRVβ使用情况在体内鉴定扩增的T细胞克隆。如果在输注前进行TCR库分析，则此类分析可用于检测输注的克隆。
--体液抗CAR免疫--
酶联免疫吸附测定(ELISA)
ELISA是标准化检测，可对人抗小鼠抗体(HAMA)17进行半定量分析。为此，将患者血清加入小鼠免疫球蛋白包被的孔中。洗涤后，与小鼠免疫球蛋白结合的人免疫球蛋白使用二抗染色可视化，抗人IgG通常与报告酶（如辣根过氧化物酶）相连。随后，监测溶液中酶介导的发光或颜色变化以进行定量。在同一检测中运行的标准能够估计HAMA水平。
基于细胞的流式细胞术
基于细胞的流式细胞术涉及将表达CAR的靶细胞（例如JurkatT细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞）与患者血清样本一起孵育，然后洗涤和二次染色以获得抗人IgG。需要额外的步骤来去除HAMA信号，从而识别与HAMA9,40,86,无关的特定抗CAR/独特型抗体。
ELISA抗药物抗体桥接试验
ELISA抗药物抗体桥接试验使用两种可溶性CAR蛋白，一种与血管表面结合，而另一种与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等报告基因相连。该复合物仅在存在抗CAR抗体的洗涤阶段固定。需要额外的步骤来移除HAMA信号。这种方法不能识别特定构象的CAR表位，这需要将整个CAR锚定到细胞膜上[10,17,31,]。通过强化淋巴细胞清除来减轻免疫原性
在CART细胞治疗之前进行的淋巴去除调理方案预计不仅会影响淋巴区室（包括B细胞和T细胞），还会影响骨髓细胞。当CART细胞在循环中和淋巴组织内扩张时，暂时去除专职抗原呈递细胞可以降低抗原交叉呈递的可能性。众所周知，基于环磷酰胺的化疗会消耗调节性T细胞，否则会限制CART细胞的抗肿瘤功效和持久性。大多数研究人员通常采用氟达拉滨/环磷酰胺为基础的淋巴去除，以改善治疗结果并克服初始CART细胞输注的免疫排斥的可能性[27,28,32]。加强该方案也正在考虑用于后续输注。有趣的是，Gauthier等人[35]证明，在第一次CAR输注之前，增强的淋巴耗竭（使用氟达拉滨加环磷酰胺与单独使用环磷酰胺相比）与部分患者对第二次更高剂量的CD19靶向CART细胞的反应改善有关。用人源化CAR和其他结构管理复发性疾病
为了避免对小鼠来源的scFv的免疫反应导致CART细胞过早失活，可以考虑使用人源化scFv的替代CART细胞产品。涉及人源化CD19靶向CART细胞构建体的早期研究报告了不同的临床反应率，包括先前输注含有小鼠scFv的CART细胞后出现进展或复发的患者。例如，Maude等人[64,]向16名对CTLCART细胞（包括小鼠衍生的FMC63scFv）无反应或疾病进展的B-ALL患者输注了另一种CD19特异性CART细胞产品（CTL，包含FMC63的人源化形式）。在这项I期研究中，16名患者中有9名(56%)在1个月时完全缓解。然而，在同一试验中，22/22的CART细胞初始疾病患者在接受CTLCART细胞产品后在这个时间点完全缓解[64]。接受再输注的患者相对较低的完全缓解率是否反映了对小鼠和人源化CAR转基因之间共有的表位的免疫反应，或者是由于其他耐药机制引起的，仍然未知[29,64,65,66,]。靶向替代抗原是另一种方法，如果归因于给定scFv内的特定表位或CAR构建体的另一个特定部分，则可能会规避抗CART细胞反应。在这些策略中，CD22导向的CART细胞是目前最成熟的B细胞恶性肿瘤替代方案。迄今为止，靶向含有全人scFv的CD22的CART细胞在使用小鼠scFv的抗CD19CART细胞治疗疾病复发患者中表现出高度的疗效，并且无论CD19表达如何，都同样有效[,,]。--结论--
CART细胞目前是治疗某些复发和/或难治性血液系统恶性肿瘤患者的重要疗法。尽管报告的疗效水平很强，抗CAR免疫反应与治疗失败有关，尽管在大多数研究中尚未确定直接因果关系。尽管如此，通过直接CAR靶向或淋巴细胞清除来消耗内源性B细胞可以降低对CART细胞的免疫反应的风险。然而，针对非B细胞恶性肿瘤（如实体瘤）的CART细胞可以诱导T细胞和B细胞反应，从而增加免疫原性的风险（图2）。这个问题增加了为实体瘤设计有效CAR免疫疗法的障碍，需要在诱导对癌细胞的有效内源性免疫和对转基因CART细胞的反应之间取得平衡。开发提高CART细胞安全性和/或功能性的技术，例如自杀基因或细胞因子自我支持，也可能会带来新的免疫原性风险。此外，同种异体供体来源的CART细胞的出现和发展引起了人们对免疫原性问题的