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TUhjnbcbe - 2021/4/29 19:36:00
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这篇综述(doi:10./j.jcyt..11.)讨论了当前和新颖的CART细胞加工方法以及这个新疗法日益增长的临床需求所需的质量控制系统。

一、CART细胞介绍

CAR是一种合成蛋白,经过基因工程改造后可以在T细胞表面表达。它包含一个细胞外结合结构域(通常是靶向肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段),一个铰链区,一个跨膜结构域和一个或多个用于T细胞活化的细胞内信号传导结构域[1]。对于任何给定的细胞表面抗原,CAR特异性均可在实验室中轻松设计[2]。

CART细胞是“活体药物”,具有在体内迁移,增殖和杀死表达同源抗原的靶细胞的能力。一系列针对B细胞抗原CD19的B细胞血液恶性肿瘤的CART细胞的早期研究已经提供了前所未有的临床反应[3-7]。全世界在临床试验.gov上注册的CART细胞已有多项临床试验,目前大多数集中在B细胞恶性肿瘤的治疗上[8,9]。这个领域正在迅速发展,现在可以使用CART细胞治疗其他恶性血液病,例如多发性骨髓瘤[10-12],霍奇金淋巴瘤[13]和T细胞淋巴瘤[14]。许多小组正在探索CART细胞是否存在实体瘤[15,16]。学术中心已经能够运行基础设施有限且无数物流和财务挑战的小型临床研究的符合GMP要求的CART制造。在计划服务交付时,必须考虑成本,监管要求,人员资源和培训,设备/存储能力以及对血液分离设备和干细胞实验室的要求[17,18]。

这篇综述着重于与CART细胞制造相关的问题和挑战,从制造实验室的GMP能力到最终产品的发布,逐步贯穿整个过程。讨论了与CART细胞制造过程各个阶段相关的关键质量指标,包括当前对释放测试的共识以及执行CART细胞效能测试的日益严格的要求。最终,目的是确保为患者发布标准化,安全和有效的CART细胞“药品”。

表1列出了用于早期临床试验的GMP设施制造产品的基本质量体系组成部分。优化GMP设施的工作流程对于满足当前对CART细胞以及人员,材料,废物和废物的多方向流动的临床需求是必要的。产品可以帮助适应竞选活动。必须采用可靠的风险评估和标准操作程序(SOP),以防止交叉污染[20,25]。

二、制造符合GMP要求的CART细胞

生产用于临床的CART细胞符合GMP标准[19,20]。GMP法规定义了一种系统,通过该系统,在严格控制、可复制和可审核的条件下,可以按照标准化方法安全地生产有效产品[20]。严格的质量控制系统应用于原材料,试剂和消耗品的采购和使用,过程中的设备和方法以及最终的“药品”产品[20-22]。

2.1CART细胞制造方法:一般原则

CART细胞在体内扩增的能力(T细胞的“适应性”)与抗肿瘤反应有关[26],并可能受到所用制造方法的影响。努力优化和质量控制制造过程的各个要素都是可取的。尽管中心之间的实践和技术有所不同,但所有CART细胞均以封闭或功能封闭的过程制造,以减少污染风险并共享图1中所示的常见步骤。GMP条件下,CART细胞的平均生产时间为12天(范围(7,19天)[9,19],并且为了防止衰竭的细胞表型,有朝着更短的离体处理(6天)迈进的一步。

图1.CART细胞制造的标准元素流程图。

CART细胞的制造存在许多问题和挑战,最好通过将制造过程分为各个组成部分来进行检查。表2对此进行了总结,并在以下各节中进行了详细介绍。

2.2使用白细胞分离术进行T细胞收获:当前实践和质量控制

制造CART细胞的关键原料是衍生自非动员白细胞分离术的CD3+T细胞。在功能封闭的系统中,根据密度梯度将单核细胞(MNC)与抗凝全血分开[27]。批准的设备包括COBESpectra,SpectraOptia(TerumoBCTInc.)和Amicus细胞分离器(FenwalInc./FreseniusKabiAG)。

没有很好地描述用于下游CART细胞制造的最佳CD3+T细胞血液分离参数。CD3+T细胞单采细胞产量低会导致体外CART细胞扩增比较困难。可以预见的是,低CD3+绝对对细胞数和/或高比例的自然杀伤(NK)细胞和原始细胞在血浆置换前的外周血细胞计数受到损害,这在患有基础疾病和/或接受过先前细胞*性化疗的患者中普遍存在。

淋巴细胞减少症患者可受益于延长的血液采血以改善T细胞产量。在UniversityCollegeLondon(简写UCL,笔者所在的单位),绝对淋巴细胞计数0.5×/L采集量从标准的2倍血液采血单采收获量升级为2.5倍体积采血,以提高获得的CD3+T细胞数量[28]。在一个美国CART细胞中心,定义了2个个CD3+T细胞的单采血液采血指标(最低阈值为0.6个个CD3+T细胞)。分别在77%和97%的患者中达到了这些目标,并且在大多数情况下,细胞数量充分扩展以产生符合释放标准的产品[28]。

从技术角度来看,淋巴细胞减少症会使用常规的血液分离方法使MNC层变窄,并使收获纯净的淋巴细胞群难度增加[27]。为了解决这个问题,TerumoBCT开发了SpectraOptia,它使用一种颜色编码系统来分离MNC层的特定部分,目的是提供富含T细胞的收获物[29,30]。在UCL,为规范操作,所有T细胞收获均在SpectraOptia上进行。

在单采血液成分基础设施,仪器,试剂和训练有素的工作人员有所不同的多站点试验环境中,至关重要的是要证明跨站点一致收集可比较的MNC产品,以最大程度地减少起始材料的变异性,以尝试进一步质量控制CART细胞为患者制造[27,32]。

2.3脱细胞后T细胞富集和初始处理步骤:质量方面

从质量控制的角度来看,非常需要标准化的细胞原料。血小板,血浆和残留的抗凝剂污染会改变T细胞对活化剂的反应性[33];红细胞和血小板会损害过程中的细胞计数和流式细胞术[34],而粒细胞和单核细胞会抑制CART细胞制造过程中的T细胞扩增和转导[]。

清洗步骤可以去除血小板,血浆和残留的抗凝剂,方法包括手动Ficoll密度梯度离心,符合GMP的封闭系统Ficoll分离和自动化过程,例如COBE细胞处理器,BiosafeSepaxII和CaridianBCTElutra[27,38]。使用逆流淘析(CFE)可以实现MNC收获物中单核细胞与淋巴细胞的分离符合GMP要求,可商购的CFE技术已用于多项CAR-T细胞临床试验(ElutraCell悬浮系统;TerumoBCTInc。)[32,39,40]。

可以使用免疫磁分离从MNC收获物中富集T细胞亚群。MiltenyiBioTech为CliniMACS和Prodigy系统提供符合GMP要求的单克隆抗体(mAb)共轭顺磁珠。制造商确认选择珠在多个洗涤步骤中已去除,并且不污染最终的患者产品。基于CD4+/CD8+磁珠在临床试验中,已经使用了选择技术来产生具有定义的CD4+/CD8+比率的CART细胞产物[5,41],并且可以使用磁珠选择CD62L+T细胞,从而在生产开始时就丰富了中央记忆T细胞亚群[42]。一些小组使用CD62L选择观察NK细胞污染,并建议先行NK细胞耗竭,其数量超过白细胞清除术总收获量的10%[43]。

在UCL,目前的做法已经从在所有情况下都使用全白细胞清除术发展到包括基于珠粒的淋巴细胞选择。这是为了最大程度地减少制造故障并在患者之间产生更一致的CART细胞产品。免疫磁选择会影响成本和制造复杂性,这一步骤在我们手中的影响将在临床研究的下游进行评估。

在此阶段,测试包括选择前和选择后样品的流式细胞仪分析,以定量选择激活T细胞之前的选择功效。对所有细胞起始材料进行扩展表型分析,以确定细胞组成以及细胞成熟和衰竭标记的表达。这些基线读数使我们能够跟踪整个制造过程中的变化,并开始了解下游培养步骤对T细胞的影响。根据表面标志物的表达,T淋巴细胞可分为没有抗原的幼稚T细胞(TN),中枢记忆T细胞(TCM),效应记忆T细胞(TEM)或终末分化效应子(TEFF),例如CD62L,CCR7,CD45RA,CD45RO和CD95。尽管TEFF和TEM细胞在体外对靶细胞具有强效的细胞*性,但分化程度较低的TCM亚类能够迁移至淋巴结并在暴露于抗原后迅速扩增,已知在体内具有更好的增殖潜力,持久性和功能性[44]。精疲力竭和衰老标记(例如CD57、2B4,PD-1,LAG-3和TIM-3)的分析可在培养期后进一步表征T细胞,并有助于预测其对抑制信号的敏感性。

图2.(a)通过在患者A和B中制造CART细胞来丰富白细胞分离收获物中存在的中央记忆T细胞群体,直到第8天进行释放测试和冷冻保存为止。增强患者T细胞的持久性。(b)白细胞去除术(第0天)和第8天(CART细胞制造过程结束)中T细胞耗竭标志物的表达。(c)说明在患有B急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的患者的自体CART细胞产品制造过程的最后一天的细胞亚型;最终产品始终具有高T细胞纯度。

图2.(b)

在患者材料中进行的扩展表型分析的一个例子如图2a所示。在图2a中,我们根据细胞表面标志物CD45RA和CCR7的表达看到了天然或中央记忆T细胞的比例。在我们部门的绝大多数制造商中,我们注意到最终CART细胞产品中中央记忆子集的丰富性。患者A和患者B的代表性图显示,在生产的第8天,超过50%的CD3+T细胞是TCM。图2b显示了患者A和B在CART细胞生产开始和结束时用尽标志物PD1和TIM3的表达(代表本单位大多数产品的图)。在此过程中,TIM3表达增加,但在第8天的释放测试和冷冻保存时,PD1表达较低。图2c是为患有B细胞恶性肿瘤(在这种情况下为B急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的患者生产的自体CART细胞产品的代表实例。它说明了用于冷冻保存的最终产物富含CD3+T细胞,而来自其他细胞类型(包括单核细胞(CD14+),NK细胞(CD16+/CD56+),自然杀伤性T(NKT)细胞(CD3+/CD16+/CD56+)和B细胞(CD19+)。尽管B-ALL白细胞去除术通常富含CD34+母细胞,但通过CD4/CD8选择可以消除这些原核,并且迄今为止,我们的制造商都没有被流式细胞仪检测到的CD34+母细胞污染。

2.4T细胞活化方法:问题与挑战

T细胞活化对于CART细胞转导效率至关重要。它是使用抗原呈递技术在体外递送并发的T细胞受体(TCR)和共刺激信号而实现的。替代方法包括使用自体抗原呈递细胞或经修饰以表达共刺激配体的细胞系。这些都是劳动密集型的,产生效率高[45]。

人工抗原呈递技术,例如吸附在塑料表面/珠子上的固定化抗CD3和抗CD28mAb,为T细胞活化提供了一种更便宜,更标准化的方法[42]。超顺磁性抗CD3/CD28抗体包被的磁珠(例如DynalDynabeads;Human-ativator)用于制造许多CART细胞产品(包括CTL,现在已获得FDA的Kymriah(Novartis)许可)[44]。在UCL,DynalDynabeads用于多项CART细胞研究。考虑到多克隆T细胞活化的潜力,质量控制要求进行经过验证的测定,以确保在输注之前从产品中有效去除DynalDynabeads。我们使用一种简单的,经过验证的形态学测定法,对每3×个细胞个珠子进行严格性分析[46]。

从技术角度来看,我们发现在GMP洁净室中去除磁珠可能既麻烦又耗时(需要多个操作员),并且与大量细胞损失有关。这促使团队探索其他非基于珠子的活化剂。一个例子是Expamer(JunoTherapeutics),一种可溶性T细胞活化试剂,其包含与低亲和力抗CD3/CD28Fab片段相关的链菌素主链。这是通过洗涤步骤[9,19]从T细胞培养物中耗尽的。

在UCL,我们拥有MACSGMPTransAct(MiltenyiBioTec)的经验,该聚合物是一种可生物降解的可聚合纳米基质,并浸有抗CD3/CD28mAb,从而消除了去除磁珠的要求[47]。

目前尚无可用于确定最终CART细胞产品中是否存在残留TransAct的测定方法,但产品信息文件报告称,T细胞转导中内置的培养液洗涤和培养基交换步骤会耗尽多余的TransAct(TCT)协议。在UCL,将概述TCT过程中TransAct稀释至可忽略水平的数学模型合并到提交MHRA批准的CART细胞研究的相关ATIMPD报告中。

2.5基因传递/转导

这可以细分为病*和非病*传递系统[48]。逆转录病*和慢病*载体是CART细胞生产中最常用的基因传递方法,约占41%和在所有制成品中分别占54%[9]。转导效率通常很高,需要T细胞激活才能进行基因转移[49]。将病*载体收获到亚批次中,并进行纯化和无菌过滤,然后进行冷冻保存和质量控制测试[50]。英国的GMP病*载体生产设施对MHRA负责,在美国对FDA负责[50,51]。

由于劳动密集型制造方法,对洁净室基础设施的要求以及释放载体所需的广泛安全性测试,病*载体非常昂贵。为了降低成本,可以使用稳定的包装细胞系生产逆转录病*载体[50]。等效的稳定慢病*包装细胞系正在开发中[52]。

逆转录和慢病*载体的潜在风险包括插入诱变和复制感受态病*(RCV)的产生。迄今为止,在多例接受CART细胞治疗的患者中尚未描述插入诱变[53]。最小化病*重组和RCV产生风险的策略包括“直接”递送瞬时转染生产细胞系(通常为HEK细胞)所需的质粒[15]。

使用“睡美人”(SB)[54,55]或PiggyBac[56-58]转座子/转座酶技术进行非病*基因递送比病*载体便宜得多。由于基因整合的随机性,存在插入诱变的风险[56],但据认为效率比病*载体要低。缺点包括基因转移效率低和需要延长体外培养以产生临床上相关的细胞数量[59,60]。SBCART细胞的试验正在进行中[43,61]。

在UCL,使用符合GMP的逆转录和慢病*载体进行CART细胞生产。由于在UCL开展的多方向战役的性质,我们采用了封闭系统的CART细胞制造方法,这些方法已在适当的风险评估中涵盖。为了严格确保在整个过程中产生的废物中缺乏载体的传染性,我们对过程中每隔一段时间收集的废物的细胞系进行滴定分析。这证实了在生产的最后阶段和在冷冻保存的产品中缺乏病*载体的感染性。

从临床风险的角度来看,MHRA规定对患者进行15年的随访,以监测RCV的出现,并在必要时进行整合部位分析。在UCL建立了长期随访诊所,以随时间推移跟踪这些患者。

2.6T细胞扩展和全自动CART细胞制造平台

基因转移后,T细胞扩增,达到功能上封闭的培养系统中临床应用所需的细胞数量[20]。可以使用多种方法,包括T瓶,平板或培养袋以及生物反应器,例如G-Rex烧瓶(WilsonWolfManufacturing),WAVE生物反应器(GELifeSystems)和CliniMACSProdigy(MiltenyiBioTec)。最近的评论表明,有43%的CART细胞临床试验使用摇摆生物反应器[46,49],而使用静态培养袋的为35%,使用T瓶的为22%[9]。

T型烧瓶不适合大规模工作,因为它们劳动强度大,并且需要在安全柜中进行多个开放式处理步骤[31,62]。静态培养袋可以通过无菌管焊接在一起,并提供半封闭培养系统,但是培养基交换是手动过程,不易扩展[63]。生物反应器具有几个优点:G-Rex烧瓶是具有优化的气体交换和采样选项的封闭系统圆柱形容器,可在培养箱中快速扩增细胞[64,65]。

GEWAVE摇摆生物反应器是一种自动化的封闭培养系统,包括放置在摇摆平台上的透气性培养袋(Cellbag;GEHealthcareLifeSciences)。内置的质量流量,pH,气压和CO2和O2浓度传感器允许自动灌注和气体交换从而减少了体力劳动和介质消耗[49,66]。WAVE的问题包括缺乏可扩展性(每个生物反应器只能生产一种产品),成本和潜在的生物学影响,例如,据报道其偏向CD4+T细胞扩增[66]。

不同研究之间对培养基的选择有所不同,并且正在朝着使用无血清制剂(例如X-VIVO10(Lonza))迈进。白介素2(IL-2)或白介素7(IL-7)加上白介素15(IL-15)对细胞因子的支持是中心依赖性的[67]。从实践的角度来看,对于任何CART细胞制造公司来说,确保其供应链并能够验证替代GMP兼容的试剂和消耗品以保护其工艺至关重要。

为了真正实现自体CART细胞生产的可扩展性,非常需要符合GMP要求的标准化自动化全封闭系统。美天旎的CliniMACSProdigy是目前使用最广泛的自动化细胞制造平台[47]。Prodigy允许根据可编程活动矩阵在一次性管道套件(TS)上进行T细胞的选择,激活,转导,扩增,取样和收获[31],并提供与表型和功能相似的CART细胞。其他方法[68]用于临床试验所需的细胞数。预选的T细胞亚群(例如CD62L或CD4和CD8)或未选择的全白细胞分离术[47,69,70]可用作起始材料,培养14天后T细胞的扩增可能超过30倍。

从质量控制的角度来看,Clini-MACSProdigy是一个有吸引力的选择,因为封闭式系统消除了对高等级洁净室的要求,通过最少的操作员操作步骤降低了产品污染的风险,并且减轻了员工的劳动强度。在临床研究中正在对以这种方式生产的CART细胞的效力和*性进行评估。在UCL,用于同种异体干细胞移植(allo-SCT)复发的CD19CART细胞同种异体移植(CARD研究)后复发的CD19+恶性肿瘤的CAR19供体淋巴细胞(NCT)是制造的CART细胞的第一项临床研究由美天旎的神童的TCT程序完成。其他生物技术公司正在开发专有的自动化细胞制造平台,以满足对产品的需求。将来,自动化可能会允许在中心辐射模型中传送CART细胞,由此卫星学术中心代表提供中央协调和质量控制的商业公司生成CART细胞[20]。

在UCL,我们使用静态培养袋,GEWAVE摇摆生物反应器和CliniMACSProdigy生产用于患者的CART细胞。所有设备均已通过GMP设施的安装和操作认证(IQ/OQ),并遵守服务合同。每隔六个月使用非必需材料(肉汤或纯培养基)进行培养基填充,以确保按照英国监管机构的要求在过程中保持无菌状态。

2.7T细胞冷冻保存

输注前冷冻保存CART细胞产品是标准做法。优点包括灵活安排患者输液时间和时间,以完成QP审核和发布所需的扩展质量控制测试。经过验证的低温保存对于大规模集中制造至关重要。

从质量的角度来看,此步骤至关重要,因为冷冻保存欠佳会导致细胞数量减少,生存能力受损以及细胞表型和功能改变[71]。大多数CART细胞制造工厂都使用为造血细胞开发的冷冻保存方法,即重悬于含有10%二甲基亚砜(DMSO)的等渗缓冲液中,转移到可控速率的冷冻机中,并在气相液氮中长期保存[20]。以这种方式冷冻保存的CD3+T细胞保持活力(融化后恢复率在50%至90%之间)[72],并保持CART细胞表型和功能[73]。较低的DMSO浓度(5%至10%)可与细胞外保护剂一起使用,例如人血清白蛋白(HSA),血浆,血清和羟乙基淀粉溶液(HES)。还提供符合GMP的商业配方,包括CryoStor,其最终浓度为2%,5%和10%的DMSO已预先配制。对于临床使用,根据欧洲骨髓移植协会(EBMT)和美国血库协会(AABB)的共识,产品的DMSO含量不得超过1g/kg。

一些小组在-80℃的机械冷冻机中被动冷冻CART细胞产品[75-77]。CART细胞的低温保存越来越多地在可编程的速率控制冷冻机(CRF)中进行,该冷冻机每分钟降低1℃的温度以避免形成细胞内冰晶。一旦充分脱水,细胞即可迅速冷却至最终储存温度,并转移至气相液氮(LN)中,以在低于-℃的温度下储存[78]。从质量的角度来看,CRF的优点包括冻结的一致性,编程的多功能性和单个产品的数据可追溯性。缺点包括与运行设备所需的大量液氮相关的高成本。新型机械CRF(例如渐近线)的运行成本较低,并且可以克服与在封闭空间中使用LN有关的一些安全问题。

在UCL,我们将CTRF中的7.5%DMSO中的CART细胞冷冻保存,然后长期保存在气相LN中。我们规定输注12mL/kg病人体重的最大CART细胞体积,以防止DMSO剂量超过每日1g/kg的法定限值。此外,我们还会根据内部验证的检测方法对单个产品进行常规稳定性测试,以确保随时间推移保存的活力,CAR转基因的表达和功能能力(细胞*性或细胞因子释放数据)。输液前,应从气相LN中提取冷冻保存的产品,并根据合同规定的优良作坊(GDP)原则,将其运输到合同规定的快递公司经温度记录,经过验证的LN医院。

三、CART细胞疗法质量保证:一般原则

GMP法规要求评估CART细胞的安全性,纯度和效力[25]。这些指标被用作质量释放标准[20]。

安全性规定了细菌和真菌的绝对无菌,并且在使用病*载体的情况下,没有RCV。基于培养的无菌方法,例如BDBacTEC系统,涉及测试接种将其放入培养基中,然后在设定的随访期内观察微生物的生长[25]。标准做法是对过程起始材料,培养基制造过程和最终产品进行基于文化的无菌评估。当需要快速结果时,革兰氏染色可以用作过程测试中的非培养方法,但通常认为它不如基于培养的方法敏感[79]。必须使用基于细胞或定量聚合酶链反应(qPCR)的试验证明RCV不存在[80]。产品生产后,在生产过程中以及通过临床研究从患者中收集和存储了用于RCV测试的样品15年[80]。还可以在外部认可的实验室或内部,通过经过验证的检测方法对样本进行支原体筛查。

纯度是指最终产品的细胞组成,是指不存在污染物(例如内*素和与制造过程有关的其他杂质)。最终产物的细胞组成和纯度可以使用流式细胞仪进行定量[20,45]。在外部认可的实验室或内部,在经过验证的测定中,从最终产品的样品中筛选出诸如内*素之类的污染物。在使用DynalDynabeads的情况下,应进行验证试验以定量最终产品中的残留磁珠[46]。这些测试应成为制成品发布标准的一部分。

效能测定是一种体外测试,旨在反映/预测体内生物学性能[81]。释放测试的效价测定应基于国际人用药品技术要求协调会(ICH)对方法学验证的要求,包括准确性,精密度,重复性,特异性,线性和耐用性的要求[82],并且应包括细胞*性的功能免疫学测定,增殖和细胞因子释放等。尝试比较不同产品时,缺乏测试CART细胞潜能的标准化方法提出了重大挑战。认识到这一点,FDA已为研究人员发布了指导书“细胞和基因治疗产品的效能测试”[83],现在建议(但不强制)进行3期临床研究的效能测定。当前的CART细胞研究依靠转导效率(CAR或标志物基因/蛋白质的细胞表面表达)的流式细胞术定量作为CART细胞功能活性的替代[46,84]。载体拷贝数评估并不总是反映细胞表面CAR表达[46]。

CART细胞放行测试

收到医生处方后,应根据COA放行CART细胞产品。COA必须详细说明释放分析方法(例如,产品标识,纯度,生存力和效力),测试地点和最低释放规范以及所获得的实际结果。释放测试应根据监管机构批准的分析方法进行。在不可能的情况下,将需要进行内部分析验证以证明分析的完整性。根据已发表的研究,所有制造商中有2-14%不符合发布规范[85]。

表3概述了CART细胞生产中常用的方形测定,并反映了UCL的当前实践。对于单个产品的释放,并非常规执行效能测试,而是在融化后进行稳定性测试的情况下,在UCL对大多数产品进行了效能测试。

三、结论

CART细胞预示着癌症治疗的激动人心的时代,并有望被广泛采用。这些疗法的标准化和经济生产仍然存在许多挑战。此外,尚不存在可用于验证CART细胞产物功效的,广泛可用的经过验证的测定法,这使得在输注患者之前比较CART细胞产物具有挑战性。

有希望的工程解决方案,标准化的生物材料和过程控制[9,86]以及自动化和封闭制造解决方案的巨大进步。加上对构成最佳CART细胞生物学的知识的加深理解,以及开发标准化的检测方法以进行更复杂的CART细胞功能测试,患者获得更好表征的产品的可能性可能会增加。

转自CytoCares

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