文章亮点：
发展了一种超分子探针来鉴定四链结构。
该探针可用于检测溶液和染色体中的四链结构。
急性髓系白血病细胞有较高的G-四联体形成。
基因组G-四联体可能成为急性髓系白血病的检测标记物。
急性髓系白血病(AML)是成人和儿童常见的急性白血病，早期发现和诊断较差。因此，寻找新的AML检测指标对有效治疗AML具有重要意义。在这里，作者开发了一种超分子探针，它对生理缓冲液、染色体和细胞中的G-四链结构表现出高度的特异性和敏感性。用该探针对从不同类型细胞中提取的DNA进行检测，发现从人急性髓系白血病细胞HL-60和KG-1中提取的DNA比从其他细胞中提取的DNA更能增强探针的荧光。这种现象可能与急性髓系白血病细胞中大量的G四联体有关，暗示G-四联体水平可能是检测急性髓系白血病的潜在指标。
背景：
急性髓系白血病(AML)是造血系统的一种可怕的恶性肿瘤，发病率高，死亡率高，表现为造血干细胞丧失正常分化能力，并滞留在不同的细胞发育阶段。未进行造血干细胞移植(HSCT)的急性髓系白血病(AML)五年生存率低于30%，近年来儿童AML发病率呈上升趋势。早期发现和诊断尤为重要，特别是对于准备接受造血干细胞移植的年轻患者。近几十年来，CD33和CLL1等表面抗原被认为是AML治疗的标志物。然而，这些标记物可以在健康的造血干细胞中找到，或者很难检测到。因此，寻找新的潜在标记具有重要意义。G-四链体是由富含鸟嘌呤(G)的核酸序列通过Hoogsten氢键形成的一种二级结构。G-四链形成序列广泛存在于人类基因组的重要区域，如癌基因启动子区域、端粒和非翻译区。令人信服的研究已经暗示了G-四链体在代谢过程中的重要生物学作用，包括癌基因的转录调节、DNA复制和端粒稳定性。这使得G-四链DNA成为药物设计的一个有前途的目标。事实上，G-四链结构并不是随机分布在基因组中的，而是经常在高等真核生物的复制起始处或许多基因的启动子区域附近发现。当某些类型的疾病发生时，细胞内G-四链水平可能与正常情况不同。Biffi的研究表明，HeLa癌细胞比MRC-5正常细胞多出30%的四联体病灶。H?nsel-Hertsch等人。发现永生化角质形成细胞的G-四联体病灶是正常人表皮角质形成细胞的~4倍。在TaChauChang等人的最新研究中，头颈部患者的G-四联体病灶大约是健康志愿者的10倍。所有这些研究表明，G-四联体的形成水平可能是疾病检测的一个有前途的指标。在作者以前的研究中，作者已经发现由菁染料MTC形成的超分子J-聚集体可以识别G-四链结构，具有很高的灵敏度和特异性。在这里，作者证明了MTC能够在染色体和细胞的复杂环境中识别G-四链结构。这种良好的检测性能使得MTC可以用来定量检测从不同细胞中提取的DNA中的G-四链。有趣的是，发现人急性髓系白血病细胞KG-1和HL-60的G-四联体形成水平高于其他细胞。提示G-四联体形成水平可能是急性髓系白血病的一个潜在指标。
研究结果：
1.MTCJ-聚集体对G-四链体的选择性识别
由于扩展的平面p电子共轭体系，MTC在生理K+和Na+溶液(mMK+和12mMNa+)下倾向于通过自组装形成J-聚集体，并在nm附近显示出一个吸收带(图1A)，该吸收带相对于MTC单体吸收带红移了近85nm。MTC单体的最大荧光出现在nm附近(图1B)，由于多亚胺链上C-C键的分子内扭曲，荧光强度很弱。一旦MTC形成J-聚集体，MTC单体的荧光就几乎检测不到了。同时，在-nm范围内出现了一个新的荧光带，这归因于J-聚集体的荧光(图1B)。这为MTC作为荧光探头提供了低背景干扰。
DNA主要以双螺旋形式存在，但在一些Grich区域，G-四链、双链和单链DNA处于动态平衡状态。已知G四链体可以根据DNA序列和环境条件形成不同的折叠拓扑。根据糖苷键角度，这些拓扑结构简单地分为三种类型：平行型、反平行型和混合型。为了评价MTC对G-四链体的选择性，在相同条件下，通过吸光度和荧光测量比较了MTC与各种核酸模型(包括平行/反平行/混合型G-四链体、单链/双链/三链DNA)的相互作用。图2a显示了添加c-mycG-四链体的MTC的吸收光谱，其中J-聚集体吸光度显著降低，而单体吸光度增加。从MTCJ-聚集体在nm处的吸光度与不同DNA浓度的关系图(图2B)中可以发现，J-聚集体的吸光度只随着变异的G-四链体的增加而急剧下降，这表明只有G-四链体才能促进J-聚集体向单体转变。随着G-四链体的加入，MTC单体的荧光也显著增加(图2C)。这是因为MTC与G-四链体相互作用后，其聚集体被分解形成更多的MTC单体，MTCC-C键的转动也受到限制。相反，当加入单链/双链DNA时，MTC单体的荧光强度几乎没有变化(图2D)，对应于MTC与其他DNA结构之间极弱的相互作用。G-四链体增强的荧光强度比其他DNA增强的荧光强度高数百倍(图2e)，与抗体Bg4相当，甚至更好。MTC与各种G-四链体的结合常数在-M-1(图2F)之间，表明MTC和G-四链体具有较高的亲和力。
MTC对G-四链拓扑也具有良好的选择性。当与Tel22G-四链相互作用时，MTC的吸光度和荧光变化比与其他四个G-四链相互作用时弱得多。已知在生理条件下端粒G-四联体主要采用反平行构型，而cMYC、C-kit、VEGF和Bcl-2的G-四联体是平行或杂交型的，两个末端G-四联体平面暴露不同，这可能是影响MTC结合的主要原因。为了验证这一点，作者使用RHPS4进行了一项竞争实验，RHPS4是一种具有末端堆叠模型的G-四链配体。
结果表明，MTC-四链体加合物的荧光被RHPS4有效猝灭，表明MTC也结合在G-四链体的末端平面上。在人类体细胞中，端粒的长度从13,到1,个碱基对不等，而且G四联体的数量可能比c-myc，cKit，VEGF和Bcl-2基因组中的要多得多。MTC对这些G-四链拓扑结构的选择性差异有利于MTC标记端粒区外的G-四链体。
除了高特异性外，MTC对G四链结构的敏感性也是值得称赞的。对于不同的G-四链体，在1-nm的范围内，MTC与G-四链体的浓度呈良好的线性关系(图4)。
这意味着可以使用MTC检测NM甚至Pm(pmol/L)G-四链。除了大量的端粒G-四链外，人类基因组中超过37万个个体序列被认为可以形成G四链结构。MTC对G四联体的高度敏感性将使MTC能够检测到从人类细胞中提取的DNA中的G-四联体。
2.染色体中G-四联体的可视化研究
利用MTC的高选择性和高灵敏度，进一步利用MTC对单个染色体上的G-四联体进行了可视化。染色体由DNA和蛋白质组成，是基因的载体，在人类细胞中承载着许多有用的生物信息。为了标记G-四链体在染色体上的位置，首先用胰蛋白酶和核糖核酸酶消化蛋白质和RNA以消除干扰。然后，在CLSM下，DAPI证实了该DNA在染色体中的存在。当MTC滴入染色体时，某些部位被特异性染色(图5)。
作者可以观察到，荧光斑主要分布在17对染色体上，其余6对染色体均未染色。被染色的染色体在荧光斑的出现频率上有很大的差异。大多数染色体只有一个荧光点，但也有7个、6个、4个、3个或2个荧光点的染色体。荧光灶主要位于端粒区外，只有23%的荧光灶位于端粒区，这与Balasubramanian的结果一致，即约75%的G四链体存在于端粒外。这一结果表明，MTC可以选择性地识别染色体中存在大量双链DNA的G-四联体。
3.细胞内G-四链体的可视化研究
在固定的HL-60细胞中，胞核和胞浆均可见均匀的MTC红色灶。为了确认MTC和G-四链体相互作用产生的荧光斑点，作者以PDS为竞争配体进行了竞争实验。PDS是一种典型的G-四链结合配体，对G-四链具有极高的选择性。当PDS加入MTC和G-四链的混合溶液中时，MTC的荧光强度急剧下降(图6A)，这意味着PDS和MTC之间存在竞争。可以推测，如果细胞核被PDS染色，细胞内MTC的荧光焦点会因为PDS的竞争而减少。正如推测的那样，有PDS的细胞核中MTC荧光焦点的数量比没有PDS的要少得多(图6B)。考虑到PDS对G-四链体具有很高的特异性，因此可以推断MTC在细胞核内的结合靶点应该是G-四链体。
4.不同细胞中G-四链水平的定量测定
为了全面比较人急性髓系白血病细胞HL-60和KG-1、急性T细胞白血病细胞Jurkat、慢性粒细胞白血病细胞K-、髓系白血病单核细胞THP-1和急性粒细胞白血病细胞Kasimi-1等多种白血病细胞的G四联体在细胞内的差异，作者选择了多种白血病细胞作为研究对象，其中包括急性T细胞白血病细胞Jurkat、慢性粒细胞白血病细胞K-、髓系白血病单核细胞THP-1和急性粒细胞白血病细胞Kasimi-1。作者还用几种非白血病细胞如肺癌细胞A、人喉上皮样癌细胞Hep-2、人纤维肉瘤细胞HT和人脐静脉内皮细胞HUVEC进行了比较。细胞培养后，用基因提取试剂盒提取每个细胞系的总DNA，并根据nm处的吸光度来定量DNA浓度(图7A)。然后将MTC加入DNA溶液中进行荧光测量(图7B)。可以观察到，HL-60和KG-1组的MTC荧光强度明显高于其他细胞组(图7C)。以等量的小牛胸腺(CT)DNA为对照，发现其他细胞组的MTC荧光强度接近或仅略高于CTDNA组。由此推测，G四链体在总DNA中的含量应该很小。在另一个实验中，作者将HUVEC与HL-60和KG-1以不同的比例混合，然后提取等量的DNA(图8a和8c)，进一步用于滴定MTC。结果，MTC单体荧光显示HL-60和KG-1细胞的比率依赖性增加(图8B和8D)，这与上述结果一致。根据上述MTC显示的荧光差异，可以预测HL-60和KG-1细胞中G四链体的含量应该略高于其他细胞系。
在生理缓冲液、染色体和细胞中证实了菁染料MTC的超分子探针对G-四链体的选择性识别。用该探针对6种白血病细胞、3种其他癌细胞和1种正常细胞的DNA中的G-四链含量进行了比较分析。结果表明，MTC与人急性髓系白血病细胞HL-60和KG-1的DNA相互作用时的荧光强度明显高于与其他类型细胞的DNA相互作用时的荧光强度。
结论：
由于各细胞系提取的DNA总量相同，DNA和MTC所处的溶液环境也相同，因此MTC荧光强度的差异应归因于G-四链结构含量的不同。虽然这项研究还需在未来结合临床实验进一步验证，但仍可启示作者
