CancerCellMDMX在从白血病 [复制链接]

撰写：于艺晞校对：鲍佳茜智仁勇

背景介绍

抑癌基因p53的突变在各种实体瘤中非常普遍，但在急性髓细胞性白血病（AML）患者中相对较少（占患者的10％）。在大多数具有WTTP53的AML中，p53蛋白的功能受到其抑制因子MurineDoubleMinute2（MDM2）和MurineDoubleMinuteX（MDMX，也称为MDM4）的抑制。特别是，与p53相互作用并阻止其反式激活的MDMX在绝大多数AML患者（约90％）中（包括干细胞水平）都过表达，部分原因是由于短形式和更稳定全长MDMX转录本之间的剪接改变。

作者前期已经证明带有WTTP53的AML对新型MDMX/MDM2双抑制剂（ALRN-）有反应，并且目前正在进行一些临床试验。然而，尚未研究MDMX过表达的对正常和恶性造血功能的影响。尽管AML的特点是患者之间具有大量遗传和表观遗传学以及患者内亚克隆异质性，但最近的大量工作已将白血病前干细胞（pre-LSCs）建立为连续转化为明显白血病的初始库。然而，尽管人们对LSC前体细胞进行了越来越多的研究和更精细的表征，但触发白血病前向明显的白血病转变的机制（即，导致遗传异常的LSC前体发展为AML的原因，而不是与广大人群的健康衰老相适应。大多数人）仍然不清楚。这促使我们在不同的，频繁发生的白血病前畸变的背景下系统地研究MDMX过表达，以评估其作为普遍的白血病向AML过渡机制的可能作用。

主要内容

1.MDMX过表达增加了造血干细胞的数量，增殖和竞争能力

为了研究MDMX在正常和恶性造血中的过度表达，作者使用了Mdmx转基因小鼠（Mdmx-Tg）分析了与WT同窝仔相比Mdmx-Tg的血液学表型，发现仅MDMX的过度表达不会引起造血功能的任何明显变化。但对BMLSK分数的更详细分析显示，与WT小鼠相比，Mdmx-Tg的表型长期HSC（LT-HSC；Flk2low，CD48low，CDhighLSK）增加了。作者通过Mdmx-Tg的体内BrdU分析与WT比较了HSC的细胞周期。Mdmx-TgHSC中BrdU的摄取显着增加，表明HSC增殖较快。此外，相对于WTBM细胞，Mdmx-TgBM细胞在甲基纤维素中显示出显着增加的系列重铺能力。以上表明，与来自WT对照小鼠的HSC相比，Mdmx-Tg小鼠中的HSC数量，增殖活性，体外系列重铺能力和体内繁殖能力均有所提高。

2.MDMX过表达可转换PU.1敲除诱导的pre-LSC

接下来，作者研究了在已知的白血病驱动畸变情况下MDMX过表达的潜在协同作用。作者将Mdmx-Tg小鼠与缺少PU.1上游调节元件URE敲除小鼠杂交，与野生型对照相比导致PU.1的表达降低了80％，并在4至8个月大时出现AML。PU.1下调在小鼠和人类中都是非常常见的白血病前期事件（50％–70％）。为了测试MDMX的过度表达是否在白血病向AML的过渡中起作用，作者向亚致死照射的NSG小鼠移植了从3个月大白血病前的URE-/-,；Mdmx-Tg或4个月大的URE-/-；具有白血的4个月大的URE-/-；Mdmx-Tg小鼠中获得的前白血病BM细胞。将一个月大的URE/;Mdmx-Tg动物放入经皮下照射的NOD-SCIDIL2R-gammanull（NSG）小鼠中。如预期的那样，来自4个月大的URE-/-小鼠的BM细胞未在受体中引起AML，但4个月大的URE-/-Mdmx-Tg动物的BM细胞足以在受体中引起明显的AML。将3个月大的时候用较年轻的白血病前URE-/-Mdmx-TgBM细胞进行移植时，尽管潜伏期稍长，但在所有受体动物中均获得了诱导明显AML的相同结果。这些发现表明，在PU.1失活的背景下，MDMX过表达在白血病发生前向AML的转移中起着致病作用。与URE-/-小鼠相比，3个月大的URE-/-Mdmx-Tg小鼠表现出中性粒细胞增多和总BM细胞计数增加，胚泡样细胞仅少量增加，表明这些小鼠仍处于白血病前期。此外，与URE-/-小鼠相比，URE-/-Mdmx-Tg与非淋巴细胞内的BMcKit+细胞之比以及包括pre-LSC/LSC分数的谱系cKit+细胞之比相比，均显着增加。与URE-/-小鼠相比，URE-/-Mdmx-Tg中的脾脏也较大，并且在URE-/-Mdmx-Tg和URE-/-小鼠中，它们主要由髓样细胞组成。总而言之，这些发现支持在PU.1敲除诱导的白血病前期模型中，MDMX过表达介导了前LSC到LSC过渡的概念。

3.MDMX过表达在Tet2-/-骨髓增生性肿瘤/骨髓增生异常综合征模型和Tet2+/-克隆性造血模型中诱导AML。

PU.1是患有MDS和AML的患者中经常遇到的白血病前驱动因素，促使作者研究其他白血病前和慢性白血病鼠模型对MDMX的影响过度表达。TET2突变代表患有骨髓增生性肿瘤（MPNs），MDS和AML的患者以及患有克隆性造血（CH）的个体中的早期事件。据报道，Tet2-/-小鼠会发展为MPN/MDS样疾病，潜伏期超过1年，而Tet2+/-小鼠可作为CH模型，许多小鼠无症状，少数则发展为轻度MPN。于是作者利用Tet2缺陷模型，将Mdmx-Tg小鼠与Tet2缺陷小鼠杂交。作者首先将Tet2-/-与Tet2-/-Mdmx-Tg小鼠进行比较，后者死亡要早得多，并且发展出一种侵略性的AML，表现为大量脾肿大，并伴有髓样浸润，高浓度的BM浸润以及cKit阳性髓细胞和CD48+CDLSK细胞的扩增。Tet2-/-小鼠仅表现出与先前报道一致的MPN/MDS样表型。此外，在Tet2+/-Mdmx-Tg组中，七分之三的小鼠在9、14和17个月大时出现了明显的AML，而Tet2+/-小鼠则没有。综上所述，MDMX过表达在Tet2缺陷以及Tet2单倍体背景下均诱导向AML的转化。

4.MDMX过表达在无症状杂合Flt3突变的背景下诱导AML

作者调查了MDMX是否在其他非白血病遗传模型中诱导白血病转化。杂合性FLT3激活突变是AML患者中最常见的突变之一。然而，Flt3WT/ITD小鼠没有发展出明显的白血病表型，寿命与WT小鼠相当。作者建立了Flt3WT/ITD;Mdmx-Tg小鼠，并将其与Flt3WT/ITD同窝仔对照进行比较。Flt3WT/ITD;Mdmx-Tg小鼠生存期比Flt3WT/ITD小鼠明显缩短，且随胚泡侵袭白细胞计数显着增加，血小板降低。这些小鼠的BM有髓系细胞大量浸润，而在Flt3WT/ITDBM中未观察到胚细胞样细胞。BM细胞的流式细胞仪分析显示，髓样前体（cKit+Gr-1+）以及未成熟谱系阴性的cKit阳性细胞显着增加，并且Flt3WT/ITD;Mdmx-Tg中CD48+CDLSK的增加。作者还分析了一组Flt3WT/ITD;Mdmx-Tg小鼠，其年龄与垂死小鼠相匹配，但尚未明显患病，与垂死小鼠的血液，脾脏和BM相比虽不严重，但也出现了AML样变化。综上所述，这些数据表明，MDMX过表达与非渗透性Flt3WT/ITD等位基因相结合会触发白血病转化并诱发明显的AML。

5.MDMX的过表达导致前LSC中Wnt/b-Catenin信号转导上调，这种作用是由MDMX与CK1a的物理相互作用介导的

为了研究可能的潜在分子机制，作者进行了RNA-seq、IP和质谱分析。对WT和Mdmx-Tg小鼠的HSC（Flk2-LSK），以及URE-/-和URE-/-；Mdmx-Tg的LSC前体（Flk2-LSK）；进行RNA-seq。与WTHSCs相比，在相对适度的范围内Mdmx-TgHSCs中p53靶标的表达受到抑制。IPA分析发现Wnt/b-Catenin是最显着上调的经典途径。基因集富集分析（GSEA）还揭示了Ctnnb1（b-Catenin）致癌信号在Mdmx-TgHSC中被上调。URE-/-和URE-/-；Mdmx-Tg的RNAseq比较；Mdmx-Tgpre-LSC也表现出Ctnnb1致癌性和Wnt/b-Catenin信号标志。除了上调Wnt/b-Catenin途径外，在URE-/-；Mdmx-Tgpre-LSC中还明显抑制了p53靶标和凋亡途径。作者通过免疫荧光（IF）染色在Mdmx-Tg，URE-/-；Mdmx-Tg和Tet2+/-;Mdmx-TgHSC/pre-LSC中证实了b-Catenin的含量增加。

接下来，作者鉴定了髓样细胞中与MDMX相互作用的蛋白质。作者用HA标签的鼠MDMX表达的慢病*载体转导了p53-WT/MDMX低表达的鼠AML细胞系32D，提取总细胞蛋白，并使用IP对HA标签进行了MDMX相互作用组筛选，然后进行了质谱分析（LC-MS/MS）。在所有相互作用的蛋白中，酪蛋白激酶CK1a（Csnk1a1）是32DAML细胞中最主要的非结构/非管家MDMX相互作用蛋白。先前的研究报道CK1a可以结合并调节其他类型细胞中的MDMX和b-Catenin。因此，作者集中研究了MDMX与CK1a的可能相互作用及其对白血病/前白血病细胞中Wnt/b-Catenin信号传导的下游影响。coIP分析验证了LC-MS/MS结果，发现MDMX确实与AML细胞中的CK1a相互作用。作者进一步假设，这种相互作用可能会阻止MDMX过表达时CK1a与b-Catenin的结合。与此假设相符，作者发现在MDMX过表达后32D细胞中总蛋白质表达以及b-Catenin的核输入增加，Ctnnb1的RNA表达水平保持不变，表明b-Catenin在蛋白质水平上受到调节。以上结果表明MDMX与AML细胞中的CK1a结合并降低了其细胞丰度，因此导致b-Catenin的核水平增加。

6.Wnt/b-Catenin抑制或CK1a水平升高可挽救MDMX过表达诱导的前LSC的功能特性

接下来，作者调查了观察到的b-catenin信号升高和CK1a隔离在功能上与MDMX过表达的pre-LSC相关。作者使用了两种Wnt/b-Catenin的药理抑制剂，WNT和PNU。集落形成试验表明，WTHSCs除在高浓度WNT情况下对耐受Wnt/b-Catenin的抑制的耐受力较好。而Mdmx-TgHSC对两种Wnt/b-Catenin抑制剂的敏感性更高。接下来，作者调查了cKit+HSPC中CK1a的逆转录病*过表达是否也以类似方式影响过表达MDMX的细胞的集落形成能力。作者对转染了CK1a的WT或Mdmx-TgHSPC进行了连续重铺检测，结果显示CK1a的过表达确实导致了第三次重铺后Mdmx-TgHSPCs菌落形成的完全抑制，而空载体转导的Mdmx-TgHSPCs则保持了较高的菌落形成能力。但没有观察到CK1a过表达时WTHSPCs的连续重铺能力有任何显着变化。

同样，URE-/-；Mdmx-Tg和Flt3WT/ITD;Mdmx-Tgpre-LSC对WNT和PNU抑制Wnt/b-Catenin敏感，而URE-/-和Flt3WT/ITDLSC则不敏感。同样，CK1a的过量表达挽救了URE-/-；Mdmx-Tg以及Flt3WT/ITD;Mdmx-Tg增强的集落形成能力，而URE-/-和Flt3WT/ITD前LSC并未受到明显影响。通过使用不同模型系统发现，增加的Wnt/b-Catenin信号传导至少部分地介导了过表达MDMX的pre-LSCs/LSCs集落形成能力的提高，且CK1a过表达可以消除MDMX过表达诱导的pre-LSC序列重铺能力的提高。

接下来，作者研究了Wnt/b-Catenin抑制剂（PNU）和ALRN-的组合是否有益，该组合通过抑制MDMX与TP53蛋白的相互作用来重新激活p53。作者发现URE-/-；Mdmx-Tg白血病前期cKit+细胞仅对PNU或ALRN-的单药治疗敏感。但是，PNU和ALRN-的组合在消除URE-/-；Mdmx-Tgpre-LSCs方面显示出强大的协同作用，且组合指数（CI）表明在URE-/-；Mdmx-Tg细胞与WT或URE-/-对照相比协同作用更强。这些数据表明，LSC之前的MDMX/CK1a/b-Catenin轴在治疗上是可靶向的。

7.MDMX驱动的HSC扩增和Wnt/b-Catenin上调与p53无关

接下来，作者探究b-连环蛋白上调和在MDMX过表达背景下产生的功能效应是否依赖于p53。因此，作者建立了Trp53-/-Mdmx-Tg小鼠。与Trp53-/-相比，Trp53-/-Mdmx-Tg小鼠的HSC过表达Mdmx20.3倍±2.4倍,并且Trp53-/-Mdmx-TgBM细胞具有显着的序列复制能力。将二者BM细胞（Ly45.2）与WT竞争者细胞（Ly45.1/2）注入致命照射的C57BL/6受体（Ly45.1）。Trp53-/-Mdmx-Tg细胞比Trp53-/-细胞显着重构了骨髓谱系。接受Trp53-/-Mdmx-Tg细胞的小鼠显示出更高比例的LSK细胞。因此MDMX的过表达增强了HSC的竞争能力，特别是髓样重构，而与其涉及p53的功能无关。且在Trp53-/-Mdmx-TgHSC中，b-连环蛋白的蛋白质水平（总的和细胞核的）及其主要靶标Ccnd1和c-Myc的RNA表达都显着增加。与此相符，使用Wnt/b-Catenin抑制剂PNU治疗会损害Trp53-/-Mdmx-TgHSC的集落形成能力，而Trp53-/-HSC则不受影响。作者在无p53的人类AML细胞系HL-60中过表达了带有FLAG标签的MDMX。虽然空载体和MDMX转导的细胞之间CTNNB1的RNA表达没有差异，但全细胞裂解液以及过表达MDMX的HL-60的细胞质和细胞核提取物中b-Catenin蛋白的表达增加细胞，并检测到了MDMX和CK1a的相互作用。总之，MDMX的过表达导致HSC扩增，并以p53独立的方式特异性增强了它们对髓系的重构。在机制水平上，MDMX与CK1a的物理相互作用也不取决于p53。

8.临床相关数据表明MDS患者中MDMX-Wnt/b-Catenin轴的相关性

作者通过分析已发表数据检查MDMX/b-Catenin轴的潜在临床意义。结果发现，MDMX过表达引起的Wnt/b-Catenin上调对于白血病前期的白血病转化非常重要，因此，作者集中研究了一组未经治疗的MDS患者，并将患者分为高表达MDMX和低表达MDMX，发现高表达MDMX的患者Wnt/b-Catenin信号丰富。除SRSF2外，在MDMX高组和MDMX低组中，CH相关基因的突变状态均相当。高MDMX的患者包括更多的难治性贫血伴过度母细胞（RAEB）病例，这是MDS的一种更为严重的亚型。接下来作者评估了将非白血病死亡作为竞争风险而向AML转化的累积发生率，发现与低MDMX表达的患者相比，在整个队列中具有高MDMX表达的MDS患者显示出更高的AML转化率，当分别分析RAEB患者和非RAEB亚型患者时，白血病死亡在所有亚组中均无显着差异。此外，同时具有高MDMX和WNT评分的患者表现出非常快速的AML病情进展，与所有其他患者相比，这种转化率差异显着。综上所述，MDMX-Wnt/b-Catenin轴在MDS患者中具有重要的功能，并且与白血病前期疾病的临床进程相关。

综上所述

作者的发现突出了MDMX过表达在白血病发生前至急性白血病进展中的重要作用，并揭示了CK1a/Wnt/b-Catenin作为治疗上可靶向的途径以及MDMX过表达的一种新的独立于p53的非经典机制。这些途径的组合靶向可能为骨髓和其他可能由MDMX引起的恶性肿瘤发病的早期阶段的精确预防和癌症拦截提供一种可能的方法。