白血病是一种骨髓细胞异常克隆的恶性疾病，临床治疗仍以联合化疗为主，且易复发、耐药。细胞凋亡是在相应的信息调节因子的刺激下，细胞出现自主的程序性死亡的过程。细胞凋亡的途径包括以Bcl-2为代表的内源性途径和以Fas为代表的外源性途径。Caspase家族分子参与内、外源性途径的信息传递，且能够直接参与并执行凋亡过程。因此，本研究选择了人慢性粒细胞白血病K和急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞株为研究对象，观察三氧免疫治疗联合化疗对这两种不同的细胞株的抑制效果及其凋亡情况，以探讨三氧免疫治疗对白血病化疗的增敏作用。实验材料细胞系和培养
人慢性粒细胞白血病K、急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞株均来源于美国ATCC，受赠于天津血液病研究所。
试验试剂、药物及仪器
高三尖杉酯碱（HHT）；三氧化二砷（As2O3）；三氧治疗仪等。
实验方法MTT法
选取对数生长期K细胞和HL-60细胞，按细胞密度接种于96孔培养板，试验组分别给予终浓度0～ng/mL的HHT，0～20μg/mL的AS2O3，每组设3个复孔，分别培养24h后，加入MTT溶液（5mg/mL）10μL，37℃孵育4h，每孔加入μL10%SDS（含0.01NHC），充分溶解结晶物，nm波长测定各孔OD值，试验3次，取平均值。计算半数抑制浓度（IC50）值并统计结果。
流式细胞术
分别收集不同处理组细胞，预冷的PBS洗涤1次，离心rpm×5min，去上清，加入预冷的PBSμL重悬细胞，按照AnnexinⅤ-PI凋亡试剂盒步骤操作，用流式细胞仪检测凋亡率。试验重复3次，取均数比较。
WesternBlot
收集处理后各组细胞，PBS漂洗2次。计数以保证试验各组细胞数目一致，按个细胞/μL加入上样缓冲液，提取细胞总蛋白，按照μg总蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，分别加入Caspase2和Casepase9单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体特异性抗体，抗体用TBST稀释抗体浓度至合适浓度，室温下与PVDF膜孵育1h或4℃过夜。化学发光法检测目标蛋白：取出μLB液加入μLA液，在凝胶成像仪观察结果。
RT-PCR检测相关凋亡基因mRNA表达
分别收集不同处理组细胞，PBS洗涤后，加入1mLTrizol抽提总RNA，逆转录合成cDNA并进行PCR扩增。Caspase2、Caspase9引物基因序列均查自PubMed。随机引物为oligo(dt)15。引物合成由上海生工完成。严格按照GelExtrationkit试剂盒步骤完成各实验组凋亡相关蛋白Caspase2和Caspase9的mRNA提取。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪观察、照相。
统计学方法
采用统计学软件SPSS17.0进行数据的统计学分析，多组间的数据比较采用重复测量数据方差分析，以P0.05为差异具有统计学意义。
实验结果细胞增殖
依据MTT结果绘制经不同浓度HHT（10、20、40、80、ng/mL）和AS2O3（2、4、8、16μg/mL）分别处理K和HL-60细胞24h后，获得各自的24hIC50值，两药联合三氧后均明显抑制了细胞增殖，差异均具有统计学意义（P0.05）。见图1。
细胞凋亡
选取作用时间24h使细胞能达到一半存活的药物剂量，即HHT20ng/mL及AS2O32μg/mL联合三氧（Ozone10μg/mL）分别作用于K及HL-60细胞株，流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示，As2O3联合三氧作用于HL-60细胞凋亡率由18.4%提高至49.7%；HHT联合三氧作用于K细胞凋亡率由20.1%提高至43.8%，两药联合三氧后均明显增加了细胞凋亡率，差异有统计学意义（P0.05）。见图2。
细胞株凋亡相关蛋白表达
分别用RT-PCR及WeasternBlot对HHT20、40ng/mL与As2O32、4μg/mL联合三氧（Ozone10μg/mL）分别作用于K及HL-60细胞株24h的细胞凋亡相关蛋白Caspase2和Caspase9进行监测发现，三氧10μg/mL联合HHT20、40ng/mL作用于K细胞均增加了Caspase2、Caspase9的mRNA水平和蛋白水平的表达；同样，三氧10μg/mL联合AS2O32、4μg/mL作用于HL-60细胞也增加了Caspase2、Caspase9的mRNA水平和蛋白水平的表达；可见三氧免疫治疗增加了化疗药物的敏感性，见图3。
三氧免疫治疗相关机制
目前，肿瘤的发生发展的分子机理是细胞分裂增殖和细胞凋亡紊乱的结果，三氧免疫治疗除了在炎症性疾病及脑梗塞的治疗中发挥作用外，在实体肿瘤如可促进乳腺癌细胞凋亡，罕见有白血病的相关报道。本实验设计首次阐述了三氧联合化疗药物对急慢性白血病株凋亡均有促进作用。Caspase-2和Caspase-9作为凋亡的启动分子，处于Caspase级联反应的起始部位；前者是定位于内质网与高尔基体的Caspase酶，主要激活在Caspase3的过程中起中介作用，也有研究推测其可以直接与线粒体相互作用，从而激活线粒体依赖的凋亡途径；后者是线粒体下游的效应酶。
本实验发现，三氧免疫治疗联合化疗后对白血病细胞株的凋亡起到了促进作用，该机制可能是激活了Caspase信号途径，启动了Caspase级联反应，可能涉及到了Caspase2/9依赖的相关途径，如活化线粒体凋亡途径，从而引起凋亡。
参考文献
《三氧联合化疗药物对急慢性白血病株凋亡均有促进作用》《临床医学研究与实践》,(16)
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德国卡特三氧
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